伽师瓜储藏期间病原菌的分类鉴定及生化特性研究

詹建立， 辛 丽， 孙 燕

(叶尔羌绿洲生态与生物资源研究实验室 喀什师范学院生地系，喀什 844006)

伽师瓜(Jiashimuskmelon)属于葫芦科(Cutrbitaceae)黄瓜属(CucumisL.)甜瓜亚属(MeloJeffrey)的一个甜瓜品种，因其源于新疆喀什地区伽师县而得名。近年来，有很多学者对甜瓜病害进行了研究。目前，全世界已发现的引起甜瓜采后病害的病原菌有20余种[1]。导致中国甜瓜贮期病害的主要病原菌为链格孢菌(Alternariaalternata)、青霉菌(Penicilliumspp.)、粉红单端孢菌(Trichotheciumroseum)和镰刀菌(Fusariumsp.)。其中，粉红单端孢菌和镰刀菌是常温下发生病害的主要病原菌，链格孢菌和青霉菌是冷藏条件下发生病害的主要病原菌[2-4]。此外，问亚军等人对渭南早春拱棚甜瓜的细菌性角班病、枯萎病和霜霉病等主要病害的综合防治技术进行了研究[5]。新疆大学的李冠教授在甜瓜免疫性的诱导和抗病基因的克隆等领域也取得了较大的进展[6-9]。

在甜瓜的病害研究中，对伽师瓜的研究也较多。孔庆军等人主要对伽师瓜的抗病基因进行了研究[10， 11]。张有林等人研究了伽师瓜采后生理和贮期病害，并探讨了贮藏保鲜技术。其结论是：伽师瓜为呼吸跃变型果实，贮期病害黑斑病病原菌为丛梗孢科(Moniliaceae)青霉属(PenicilliumLK,ex Fries)的鲜绿青霉(P.viridicatumWestling)。TBZ熏蒸和壳聚糖涂膜对PPO、POD、PE酶活性和病原菌抑制作用显著[12]。伽师县克孜勒博依乡农技站的阿迪力·吐尔逊等人对伽师瓜白粉病、霜霉病等病害的常规防治技术进行了探讨[13]。另外， 新疆农科院植保所在喀什地区和阿勒泰地区建立了甜瓜病害监测网络，建成了甜瓜霜霉病预测和控制的计算机技术分析平台[14]。

本研究对伽师瓜生长和贮藏期间病瓜上的微生物进行了初步的分类鉴定，并通过细菌学检测和Koch法则验证初步推断了伽师瓜可能的病原菌。这将为伽师瓜的病害防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 伽师瓜病瓜的采集

采集生长和贮藏期间的伽师瓜病瓜。

1.1.2 主要试剂

PCR preMix、EDTA-Na2、Tris、CTAB、EB、SDS和Agarose等购自大连宝生物有限公司(TaKaRa)。16S rRNA和18S rRNA引物由上海捷瑞生物责任有限公司合成，回收DNA使用TaKaRa公司的the Gel Extraction Mini Kit (50次)。

1.2 方法

1.2.1 微生物的分离

样品采集后制备样品悬液：用75%的酒精擦洗病变的伽师瓜瓜皮，然后用无菌水冲洗数次，在无菌条件下选取病瓜病灶部位并放入95 mL无菌水中，振荡10 min，制成稀释度为10-1的菌悬液。取200 μL样品稀释液涂布接种于牛肉膏培养基、查氏培养基和马丁氏培养基平板上，分别于37℃和28℃培养。

1.2.2 微生物总DNA的提取

取分离得到的微生物单个菌落进行16S rRNA 和18S rRNA 基因序列分析。细菌总DNA的提取按照CTAB法进行[15]。用改良 CTAB 法提取霉菌总DNA[16]。酵母总DNA的提取按照文献[17]进行。

1.2.3 病原菌16S/18S rRNA基因的扩增

将染色体DNA作为PCR扩增的模板。DNA扩增反应(25 μL反应体系)：9.5 μL无菌水，1 μL引物1，1 μL引物2，12.5 μL rTaq酶和1 μL模板DNA。PCR反应条件：细菌：94 ℃，30 s；55℃，30 s；72℃，2 min。真菌： 94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，2 min。霉菌：94℃，30 s；53℃，30 s；72℃，2 min。

1.2.4 病原菌16S rRNA和18S rRNA基因克隆的产物纯化

用DNA胶回收试剂盒对克隆基因进行回收和纯化。

1.2.5 病原菌16S rRNA和18S rRNA基因测序

扩增产物直接进行测序，委托北京奥科鼎盛有限责任公司测序。

1.2.6 病原菌16S rRNA和18S rRNA基因序列分析

测序结果通过http://www.ncbi.nih.nlm.gov网站进行BLAST序列比对。同时，利用Mega 4.1软件构建系统进化树。

1.2.7 病原菌常规细菌学及Koch假说测定

将伽师瓜幼苗进行土培，接种时先用70%的酒精对幼苗叶片表面消毒，然后用针蘸取在培养的菌体悬液针刺和涂抹接种，各个菌株分别接3片幼苗叶片，每片幼苗叶片接种2个部位，以无菌水作对照。接种后逐日观察发病情况。待发病后，从发病幼苗叶片进行病原菌再分离，以进行柯赫氏法则实验，获得的纯培养分离菌株用于进行微生物学性状测定。

1.2.8 病原菌的生理生化

明胶液化实验、甲基红实验、油脂水解试验、淀粉水解试验、果聚糖产生试验、接触酶实验和葡萄糖氧化发酵实验按照文献[18]进行。

2 结果与分析

2.1 伽师瓜微生物的分离

通过平板稀释涂布法，本研究从伽师瓜病瓜中初步分离得到2株细菌、3株酵母菌和8株霉菌。

2.2 伽师瓜病原菌总DNA的提取

本研究对伽师瓜病瓜上分离到的可能病原菌提取了总DNA(见图1)。

图1 伽师瓜病原菌总DNA的提取电泳图

2.3 伽师瓜病原菌16S rRNA和18S rRNA的扩增

伽师瓜病原细菌的16S rRNA序列扩增结果表明，从伽师瓜病瓜上分离的细菌1、细菌2、细菌3和细菌4的16S rRNA片段得以扩增，且片段大小约为1500 bp(如图2)。

伽师瓜病原霉菌的18S rRNA序列扩增结果表明，从伽师瓜病瓜上分离的霉菌1～10的18S rRNA片段得以扩增，且片段大小约为500～750 bp之间(如图3)。

图2 伽师瓜病瓜分离细菌的16S rRNA基因电泳图

图 3 伽师瓜病瓜霉菌基因组的电泳图

图4 伽师瓜病瓜酵母基因组的电泳

伽师瓜病原酵母的18S rRNA序列扩增结果表明，从伽师瓜病瓜上分离的酵母1～10的18S rRNA片段得以扩增，且片段大小约为500～750 bp之间(如图4)。

2.4 伽师瓜病原菌16S rRNA和18S rRNA的测定

扩增片段经纯化后由北京奥科鼎盛有限公司测序，其中测出的可比对序列有2株细菌、8株霉菌和3株酵母菌。

图5 伽师瓜病瓜分离菌株16S rRNA 和18S rRNA基因进化树

2.5 伽师瓜病原菌16S rRNA和18S rRNA的序列分析

本研究从伽师病瓜上分离到的B2细菌与Pantoeasp.Enrichmentcultureclone(EU784083)在同一个分支上，同时其与Enterobactercloacae(HQ179578)在一个大分支上。因此可以初步推断B2细菌可能隶属于泛菌属(Pantoea)或肠杆菌属(Enterobacter)，前者是农作物的致病菌之一(见图5)。

因此，本研究对从伽师病瓜上分离到的B2、B4、M1、M5、M6、M7、M10、M11、M12、M13、Y3、Y14和Y15等13株菌株进行16S rRNA全基因序列和18S rRNA基因部分序列分析。结果表明，B2可能隶属于泛菌属或肠杆菌属，B4可能隶属于芽孢杆菌属(Bacillus)，M1可能隶属于毕赤酵母属(Pichia)，M11和M12可能隶属于酵母菌属(Pichia)或白假丝酵母属(Candida)，M5、M7和M10青霉属(Penicillium)，M6可能隶属于正青霉属(Eupenicillium)，M13可能隶属于地霉属(Galactomyces)，Y3和Y14可能隶属于酵母属(Candida)，Y15可能隶属于真菌(fungus)。

因为泛菌属、酵母菌属或白假丝酵母属和地霉属均是果蔬的致病菌，因此，本研究初步推断伽师瓜生长和贮藏期间的可能病原菌是B2、M1、M11、M12、Y3和Y14。

2.6 伽师瓜病原菌的科赫法则验证和宿主确定

通过对伽师瓜病瓜样品进行分离纯化后获得的上述13个分离菌株分别进行伽师瓜、甜瓜和油白菜幼苗叶片离体针刺涂抹接种。8～16 d后，伽师瓜可能病原菌B2、M1、M11、M12、Y3和Y14接种后的伽师瓜和甜瓜植株叶片周围部分发黄、萎蔫、植株出现倒伏而对照植株幼苗没变枯黄，且生长良好。再次对分离到的伽师瓜和甜瓜枯黄、萎蔫的幼苗叶片的病原菌进行形态学观察，发现与最初获得的分离菌株形态相同。因此，再次推测B2、M1、M11、M12、Y3和Y14是伽师瓜的可能病原菌。同时也推测伽师瓜可能是这几株可能病原菌的宿主，而油白菜不是其宿主。

2.7 伽师瓜病原菌的生理生化实验

本研究对伽师瓜病原菌进行了明胶液化、甲基红试验、油脂水解、淀粉水解、果聚糖产生实验、接触酶实验和糖发酵实验等生理生化实验。结果表明，仅有B4、M1和M10菌株能够液化明胶，B2、M7、M13、Y3、Y14甲基红实验呈阳性，M1、M6、M12、M13、Y3和Y14水解油脂，M1、M6、M13、Y14和Y15产果聚糖，B2、M11、Y14和Y15接触酶反应不产气泡呈阴性，B4、M5、M10、Y14和Y15发酵葡萄糖产酸，B4、M5、M7、M10、M13、Y3、Y14 和Y15能够水解淀粉(见表1)。

表1 伽师瓜病原菌的生理生化实验

3 讨论

本研究从贮藏期的伽师瓜病瓜上分离到了13株菌株，通过16S rRNA全基因序列 和18S rRNA部分基因序列分析，初步确定了可能的病原菌为B2、M1、M11、M12、Y3和Y14。通过生理生化分析得出：在生长和储藏期间，使伽师瓜致病的细菌为产酸型、且在生活状态中，表现出不能产生分解蛋白质、淀粉和油脂的胞外酶。另外，伽师瓜致病的主要病源菌是霉菌和酵母菌。这可能和伽师瓜的含糖量高的特性有关。

通过本研究的结果，可以有三点启示：一是利用这些致病菌的某些特性，象生化特性，如M1和Y14都能够产生果聚糖，而果聚糖是对人身体有益的成分，所以，如果能够变这些致病菌为提高伽师瓜品质的有益菌是很有意义的尝试。二是从分子生物学角度思考，根据这些致病菌的基因序列和生化特性，进行转基因甜瓜抗病品种的研究，开发伽师瓜体内的抗性基因，以对抗致病菌的生物化学特性，使其不能存活，从而达到提高其抗病能力的目的。目前，这方面的研究比较多，诸如对蔗糖合成酶编码基因的相关研究[19， 20]。三是在推动本土微生物的基础研究的基础上，建立瓜类品种微生物致病菌库，给果蔬的微生物学防治提供平台。

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