聚羟基脂肪酸酯合成酶的改造和代谢途径构建的研究进展

李 浩， 黄媛媛， 李 曼， 宋水山

(1. 河北工业大学化工学院，天津300130； 2. 河北省科学院生物研究所，石家庄050051；3. 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心，石家庄050081)

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是微生物在非平衡生长(如碳源过剩，氮氧、磷、铁等营养缺乏)条件下在胞内积累的碳源和能源储存物质，具有生物降解性和生物相容性，是替代化学常规塑料的理想材料，也在生物医学方面极具应用前景[1]。PHA是一类由3-羟基脂肪酸组成的线性聚酯，根据组成PHA单体的碳链长度可以把PHA分为两大类：短链PHA和中长链PHA。短链PHA单体主要由3～5个碳原子组成，其材料性质与化学塑料聚丙烯较为接近。中长链PHA的单体主要由6～14个碳原子组成，其材料性质与橡胶、弹性纤维较为接近。最近研究发现，如果在聚-3-羟基丁酸[P(3HB)]的骨架中插入少量的中长链的单体，可以合成像聚乙烯那样的低密度材料[2-8]。

PHA生物合成过程主要涉及两个反应步骤：一是利用各种代谢分子合成单体羟酰基辅酶A (3-hydroxyacyl-CoAs,HA-CoAs)；二是PHA聚合酶使HA-CoAs聚合生成PHA。聚-3-羟基脂肪酸酯因具有生物可降解性、光学活性、抗紫外辐射、生物相容性等许多优点而被研究最为广泛。但P(3HB)易脆，柔软度差，后期加工性能差。为了促进PHA的商业化，满足不同应用领域对材料性能的要求，需要合成具有不同性能的PHA。PHA聚合酶的活性、底物特异性以及微生物代谢途径决定着PHA的单体组成，进而影响着PHA的理化特性和材料性能。本文将概述PHA合成酶分子改造和PHA合成代谢工程方面的研究进展，并讨论含稀有单体PHA的合成。

1. PHA合成酶的分类及改造

根据PHA合成酶的亚基构成和底物特异性的差异，PHA合成酶大致可以分为I、 II、 III和IV等4类。I、II类PHA合成酶只有一个PhaC亚基。I类PHA合成酶可以利用短链HA-CoAs为底物，而II类的PHA聚合酶可以利用短链HA-CoAs，也可以利用长链HA-CoAs为底物[9,10]。III类PHA合成酶由PhaC和PhaE两个亚基组成，其亚基末端序列与I类、II类的PHA合成酶具有一定的同源性，例如PhaC亚基与I类、II类相比存在20%～30%的同源性。III类PHA合成酶对短链的HA-CoAs具有很高的特异性，但是在一些假单胞菌中它也可以聚合中长链的HA-CoAs合成PHA[11]。IV类PHA合成酶由PhaC和PhaR两个亚基组成，主要存在于芽孢杆菌中[12,13]。如图1所示，不同类型的PHA合成酶利用不同种类的HA-CoAs作为底物聚合生成含有不同单体的PHA。

不同类型的PHA合成酶具有不同的底物特异性。一般来说，PHA合成酶对短链HA-CoAs的选择性强，而对长链HA-CoAs的选择性较差。如要生物合成含有中长链脂肪酸单体和短链脂肪酸单体的共聚物，尚需要发掘新的天然PHA合成酶或对天然PHA合成酶进行定向分子改造。

图1 不同种类的PHA合成酶的亚基组成及其底物特异性

Matsusaki等首先发现来自于假单胞菌Pseudomonassp. 61-3中的PHA合成酶可以利用聚合短链的单体也可以聚合中长链的单体，在以葡萄糖酸钠为唯一碳源培养时，合成由C4、C6、C8、C10和C12的3HA单体组成的PHA。其合成酶基因phaC1和phaC2的氨基酸序列与P.oleovorans和P.aeruginosa的PHA合成酶基因有较高的同源性，并且Pseudomonassp. 61-3的合成酶基因phaC1和phaC2之间的同源性也达到了53.2%[14]。Amara等人发现Aeromonascaviae中的PHA合成酶也可以高效聚合3HB-CoA和3HHx-CoA两种单体，产生P(3HB-co-3HHx)。A.caviae的PHA合成酶的基因与Acinetobactersp和R.eutropha的PHA合成酶的同源性较高，分别为45.1%和42.7%[15]。Kesaven等人发现的Chromobacteriumsp. USM2的PHA合成酶可以同时聚合3HB、3HHx和3HV，并且它的酶活是同属的其他菌酶活的8倍左右。把USM2的合成酶基因插入到大肠杆菌中，以葡萄糖为碳源培养24 h后，P(3HB)的累积量可达细胞干重的(76±2)%[16]。Chung等人研究发现P.entomophilaL48积累的PHA中由4种单体组成，其中3HD占38.6mol%、3HO占44.5mol%[17]。

在对PHA合成酶的分子改造方面，Matsumoto等人在Pseudomonassp. 61-3 PHA合成酶中发现了4个关键的氨基酸位点(Glu130、Ser325、Ser477、Gln481)，它们可以使聚合酶在特异性聚合3HB-CoA同时也不影响对中长链3HA-CoA单体的聚合活性。这4个氨基酸位点的突变，明显提高了P(3HB)的合成，与野生型相比，大约提高了340～400倍。更重要的是当这些氨基酸位点发生改变时，可以使大多数Pseudomonas中的II类PHA合成酶聚合3HB-CoA[18]。利用Pseudomonas中II类的PHA合成酶或者突变过的酶已成功的合成出了P(3HB-co-3HA)的共聚物，其中3HB单体的含量超过95 mol%。

Amara等人对A.punctata的PHA合成酶进行随机突变，从200000个突变体中筛选PHA合成酶活性提高的突变体，其中发现两个单突变体F518I和V214G可以提高合成酶的胞外活性至原来的2～5倍，但是PHA的积累量只提高7%～20%[19,20]。暗示PHA合成酶的胞外活性与PHA的积累量可能没有必然的联系。同时也发现在这些突变体中，所合成的PHA的分子量也有所增加，但是聚合物中单体3HB和3HHx的摩尔分数没有明显的改变。同样在A.caviae中另外两个PHA合成酶突变体N149S和D171G中，合成酶的胞外活性提高了21%～56%， PHA的积累量与野生型相比提高了6.5倍，并且聚合物中3HHx所占的摩尔分数也提高了10%～18%。在对A.caviae的进一步研究中，利用N149S和D171G两个位点的双突变体NSDG研究时发现，在以辛酸钠为碳源时，产生的PHA聚合物中3HO单体占0.4mol%，而3HHx占18.1mol%[21,22]。以果糖为碳源时可以使合成的P(3HB)的平均分子量达到3.68×106Dr。

Xue等人对Pseudomonasstutzeri1317的PHA合成酶的密码子及mRNA的结构进行了优化，利用添加的发卡结构增加了mRNA的稳定性[23]。优化后的合成酶基因导入大肠杆菌，发现与未优化的合成酶相比，优化后的重组大肠杆菌中PHB的积累量提高了16倍。当以十二烷酸盐为碳源时，可以合成由3HB和中长链单体3HA单体组成的共聚物P(3HB-co-3HA)，并且比原来的积累量提高了4倍。

2 PHA合成的代谢工程

4HB的引入可以显著改善P(3HB)的材料性能，因此，P(3HB-co-4HB)的生物合成受到了广泛关注[24]。Hein等人把R.eutropha的PHA合成酶基因和C.kluyveri的CoA转移酶基因插入到大肠杆菌中，此重组后的大肠杆菌在含有葡萄糖和4HB的培养基中培养，可以合成得到P(4HB)的均聚物。但在培养基中只加入4HB时，合成的PHA为P(72mol%3HB-co-28mol%4HB)。说明存在未知的代谢途径可以把4HB转化为3HB，而葡萄糖的存在可能抑制了这种转化。

如果想直接利用葡萄糖为碳源合成4HB-CoA，就需要其他酶的参与。Valentin等人研究发现三种重要的酶：琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶和CoA转移酶，通过它们的作用可以从葡萄糖中合成4HB-CoA，如图2所示。在重组的大肠杆菌里利用上述的方法成功合成了P(3HB-4HB),但是因为单体4HB只占2.8mol%，所以还不足以影响整个材料的性质。Li后来在此方法的基础上进行了改良，阻止琥珀酸半醛转化为琥珀酸盐，可以把PHA中4HB单体的比例提高到11mol%。如果在培养基中补充α-酮戊二酸或者柠檬酸，可以使PHA中4HB的比例提高到20%[25]。宋水山等构建的重组质粒，可以利用TCA中间代谢产物合成出4HB单体，利用此质粒转化的大肠杆菌可以合成纯的P(4HB)[26]。

Valentin等人在合成含有3HP的PHA中也是采用了类似合成P(3HB-4HP)的方法。他们在大肠杆菌里导入了R.eutropha的PHA合成酶和Salmonella enterica serovar Typhimurium的丙酰-CoA合成酶(PrpE)两个基因。当此重组的大肠杆菌在含有3HP的培养基中培养时，就可以合成共聚物P(3HB-3HP)[27]。

Fukui等人在R.eutropha中也建立一种可以合成P(3HP-3HP)的代谢途径。携带丙二酰-CoA还原酶和3HP-CoA合成酶基因的重组R.eutropha可以利用一些结构无关的碳源如果糖或是脂肪酸来合成P(3HP-3HP)，其中单体3HP所占的比例为2.1mol%[28]。最新研究出的合成含有3HP的PHA的代谢途径是把C.butyricum的甘油脱氢酶、S.enterica的丙醛脱氢酶和R.eutropha的PHA合成酶基因整合到大肠杆菌中，重组后的大肠杆菌以甘油为碳源培养，可以生成P(3HP)，占总的聚合物质量的11.98%[29]。

图2 在重组的E.coli中PHA合成的代谢途径

为了能在生产P(3HB-3HA)的过程使用一些结构不相关的碳源如：糖类、脂肪酸或油类物质，有必要开发出新的代谢途径，既能大量合成中长链的3HA-CoAs单体，又能合成特定单体比例的聚合物。以前的研究结果表示大部分的 P(3HB-3HA)中，除了P(3HB-3HHx)都很难准确地控制聚合物单体间的比例。不过在最新研究中，Gao等人通过新构建的代谢途径，利用重组的恶臭假单胞菌(P.putida)可以生产出中长链单体的均聚PHA，而利用这种新构建的代谢途径，有可能控制合成的P(3HB-3HA)中单体的比例[30-32]。最近对P.putidaKT2442的研究发现，可以生产出一系列中长链单体聚合而成的PHA均聚物。Wang等人构建的重组E.coliXL1-Blue中，把P.resinovorans的PhaC1基因及其它一系列基因导入其中，当在含有乳酸的培养基中培养时可以产生PLA的均聚物，若以癸酸或者正十二烷酸为碳源培养时，则可以分别合成聚3-羟基癸酸和聚(3-羟基癸酸-84mol%3-羟基十二烷酸)。

Yang等人为了聚合3HV单体，在大肠杆菌中插入了丙酰辅酶A转移酶(pct)以及R.eutropha的PHA合成酶等基因。其中丙酰辅酶A转移酶可以高效的合成丙酰辅酶A进而合成出3HV单体。合成此重组后的大肠杆菌可以合成出P(HB-co-HV)，并且3HV单体占总聚合物质量的80%以上[33]。

3 生物合成含有2-羟基酸的PHA

Tsuji等人研究发现，PHA中的2-羟基丁酸(2HB)单体可以形成立体络合结构，可以显著提高PHA的热学性能和材料性能[34]。目前在自然界中，还没有发现可以合成含有2-羟基脂肪酸(2-HA)单体PHA的细菌。因此需要研究出可以合成含有2-羟基脂肪酸单体PHA的代谢途径和PHA合成酶。

Han等人在对I、II、III和IV类的PHA合成酶进行大量的筛选后发现，R.eutrophaH16的PHA合成酶可以合成含有2HB单体的PHA共聚物，并且聚合过程要以3HB-CoA为起点，得到聚合物为P(3HB-9mol% 2HB)。但在目前的研究中，还不能合成出均聚物P(2HB)。

Matsumoto等人构建的重组大肠杆菌LS5218，导入了Pseudomonassp 61-3 PHA合成酶的突变基因、M.elsdenii的Pct基因和P.aeruginosa的烯酰-CoA水合酶基因。当LS5218在含有乙醇酸盐和十二烷酸盐的培养基中培养，合成出含有2-HA和中长链3-HA组成的共聚物，平均分子量可以达到34000 Dr。

最近Park等人新构建的重组大肠杆菌导入了基因PhaC1Ps6-19和PctCp，其可以利用结构不相关的碳源合成含有2HB单体的PHA。随着培养基中2HB和3HB的浓度变化，合成的PHA中2HB的单体的摩尔百分数在10mol%到60mol%之间变化。当加入的2HB浓度为2 g/L，3HB浓度为0.5 g/L时，合成的PHA中2HB单体的摩尔百分比达到最高61mol%,占PHA重量的26.7%。

另一个重组的大肠杆菌XLdh导入了PhaC1Ps6-19、PctCp、CimA、LeuBCD和PanE基因，使它可以利用培养基中的3HB，合成含有单体2HB、3HB和少量乳酸单体的PHA。如果在此大肠杆菌中导入R.eutropha的β-酮硫酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶，就可以利用葡萄糖作为单一的碳源合成P(2HB-3HB-LA)，此时共聚物中2HB的摩尔百分比减少到了3mol%，可能是因为乙酰-CoA在合成2HB-CoA、3HB-CoA和lactyl-CoA3个单体中，主要用于合成PHA中的3HB-CoA，生成的聚(47 mol% 2HB-50 mol% 3HB-3mol% LA)的平均分子量、聚合度和玻璃化温度分别是20000、1.69和9.7 ℃[35]。

4 展望

尽管目前还不知道PHA合成酶的精确结构，但突变体分析已经发现影响PHA合成酶活性和底物特异性的关键氨基酸位点，通过PHA合成酶的分子改造可以进一步提高生物PHA合成酶活性的效率及增加合成PHA的种类。利用基因工程技术可以构建合成多种单体及不同比例的代谢途径，进而合成满足不同实际需求的PHA，促进PHA的商业化进程。目前对PHA合成的研究，也很重视如何从低廉的碳源中更高效经济的获得PHA。目前很多研究结果展示，许多自然界中的微生物可以从淀粉，废弃的脂肪酸甚至工业中的废水中合成PHA。这样既能变废为宝又能对环境产生积极的影响。此外，在细菌中有很多的调控系统对PHA的合成具有明显的影响，如群体感应系统、双因子调控系统和转录调节因子等。如果能清楚地了解这些机制，就能使我们做出更好的应对机制，提高PHA的合成效率。

[1]Song S H,Hein S,Steinbüchel A. Production of poly(4-hydroxybutyric acid) by fed-batch cultures of recombinant strains ofEscherichiacoli[J]. Biotechnol Lett,1999,21(3): 193-197.

[2]Matsumoto K,Aoki E,Takase K,et al. In vivo and in vitro characterization of Ser477X mutations in polyhydroxyalkanoate (PHA) synthase 1 fromPseudomonassp. 61 3: effects of beneficial mutations on enzymatic activity,substrate specificity,and molecular weight of PHA [J]. Biomacromolecules,2006,7: 2436-2442.

[3]Matsumoto K,Nakae S,Taguchi K,et al. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoates) copolymer from sugars by recombinantRalstoniaeutrophaharboring thephaC1Psand thephaGPsgenes ofPseudomonassp. 61 3 [J]. Biomacromolecules,2001,2: 934-949.

[4]Matsumoto K,Takase K,Aoki E,et al. Synergistic effects of Glu130Asp substitution in the type II polyhydroxyalkanoate (PHA) synthase: enhancement of PHA production and alteration of polymer molecular weight [J]. Biomacromolecules,2005,6: 99-104.

[5]Matsumoto K,Ishiyama A,Sakai K,et al. Biosynthesis of glycolate-based polyesters containing medium-chain-length 3-hydroxyalkanoates in recombinantEscherichiacoliexpressing engineered polyhydroxyalkanoate synthase [J]. Biotechnol,2011,156: 214-217.

[6]Park S J,Lee S Y. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoates) by metabolically engineeredEscherichiacolistrains[J]. Appl Biochem Biotechnol,2004,114:335-346.

[7]Takase K,Matsumoto K,Taguchi S,et al. Alteration of substrate chain-length specificity of type II synthase for polyhydroxyalkanoate biosynthesis by in vitro evolution: in vivo and in vitro enzyme assays [J]. Biomacromolecules,2004,5: 480-485.

[8]Takase K,Taguchi S,Doi Y. Enhanced synthesis of poly(3-hydroxybutyrate) in recombinantEscherichiacoliby means of error-prone PCR mutagenesis,saturation mutagenesis,and in vitro recombination of the type II polyhydroxyalkanoate synthase gene [J]. Biochem,2003,133: 139-145.

[9]Matsusaki H,Manji S,Taguchi K,et al. Cloning and molecular analysis of the Poly(3-hydroxybutyrate) and Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoate) biosynthesis genes inPseudomonassp. strain 61 3 [J]. Bacteriol,1998,180: 6459-6467.

[10]Song A J. Cloning of newPseudomonassp. MBEL 6 19 polyhydroxyalkanoate synthase genes and their use in the development of recombinant microorganisms[D]. M S Dissertation,KAIST,2004.

[11]Liebergesell M,Rahalkar S,Steinb chel A. Analysis of theThiocapsapfennigiipolyhydroxyalkanoate synthase: subcloning,molecular characterization and generation of hybrid synthases with the corresponding Chromatium vinosum enzyme [J]. Appl Microbiol Biotechnol,2000,54: 186-194.

[12]McCool G J,Cannon M C.PhaCandPhaRare required for polyhydroxyalkanoic acid synthase activity inBacillusmegaterium[J]. Bacteriol,2001,183: 4235-4243.

[13]Satoh Y,Minamoto N,Tajima K,et al. Polyhydroxyalkanoate synthase fromBacillussp. INT005 is composed ofPhaCandPhaR[J]. Biosci Bioeng,2002,94: 343 350.

[14]Matsusaki H,Manji S,Taguchi K,et al. Cloning andmolecular analysis of the Poly(3-hydroxybutyrate) and Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoate) biosynthesis genes inPseudomonassp. strain 61 3 [J]. Bacteriol,1998,180: 6459-6467.

[15]Fukui T,Doi Y. Cloning and analysis of the Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) biosynthesis genes ofAeromonascaviae[J]. Bacteriol,1997,179: 4821-4830.

[16]Kesaven B,Jo-Ann C,Fumi S. Characterization of the highly active polyhydroxyalkanoate synthase ofChromobacteriumsp. Strain USM2 [J]. Applied and Environmental Microbiology,2011,5: 2926-2933.

[17]Chung A L,Jin H L,Huang L J,et al. Biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxydodecanoate) by β-oxidation inhibited mutant ofPseudomonasentomophilaL48 [J]. Biomacromolecules,2011,12(10): 3559-3566.

[18]Yang T H,Jung Y K,Kang H O,et al. Tailor-made type IIPseudomonasPHA synthases and their use for the biosynthesis of polylactic acid and its copolymer in recombinantEscherichiacoli[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2011,90:603-614.

[19]Amara A A,Steinuchel A,Rehm B H A. In vivo evolution of theAeromonaspunctatapolyhydroxyalkanoate (PHA) synthase: isolation and characterization of modified PHA synthases with enhanced activity [J]. Appl Microbiol Biotechnol,2002,59: 477-482.

[20]Kichise T,Taguchi S,Doi Y. Enhanced accumulation and changed monomer composition in polyhydroxyalkanoate (PHA) copolyester by in vitro evolution ofAeromonascaviaePHA synthase [J]. Appl Environ Microbiol,2002,68: 2411-2419.

[21]Tsuge T,Watanabe S,Sato S,et al. Variation in copolymer composition and molecularweight of polyhydroxyalkanoate generated by saturation mutagenesis ofAeromonascaviaePHA synthase [J]. Macromol Biosci,2007a,7: 846-854.

[22]Tsuge T,Watanabe S,Shimada D,et al. Combination of N149S and D171G mutations inAeromonascaviaepolyhydroxyalkanoate synthase and impact on polyhydroxyalkanoate biosynthesis [J]. FEMS Microbiol Lett,2007b,277: 217-222.

[23]Gao X,Yuan X X,Shi Z Y,et al. Production of copolyesters of 3-hydroxybutyrate and medium-chain-length 3-hydroxyalkanoates by E. coli containing an optimized PHA synthase gene [J]. Microb Cell Fact,2012,14;11:130.

[24]宋水山. 利用重组大肠杆菌产聚-4-羟基丁酸的研究[J]. 微生物学通报,2002,29(1): 10-14.

[25]Li Z J,Shi Z Y,Jian J,et al. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineeredEscherichiacoli[J]. Metab Eng,2010,12: 352-359.

[26]宋水山,马 宏,高振贤,等.以葡萄糖为唯一碳源合成聚-4-羟基丁酸的重组大肠杆菌的构建[J]. 微生物学报,2005,45(3): 382-386.

[27]Valentin H E,Mitsky T A,Mahadeo D A,et al. Application of a propionyl coenzyme A synthetase for poly(3-hydroxypropionate-co-3-hydroxybutyrate) accumulation in recombinantEscherichiacoli[J]. Appl Environ Microbiol,2000,66: 5253-5258.

[28]Fukui T,Suzuki M,Tsuge T,et al. Microbial synthesis of poly((R)-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxypropionate) from unrelated carbon sources by engineeredCupriavidusnecator[J]. Biomacromolecules,2009,10:700-706.

[29]Andreessen B,Lange A B,Robenek H,et al. Conversion of glycerol to poly(3-hydroxypropionate) in recombinantEscherichiacoli[J]. Appl Environ Microbiol,2010,76: 622-626.

[30]Li S Y,Dong C L,Wang S Y,et al. Microbial production of polyhydroxyalkanoate block copolymer by recombinantPseudomonasputida[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2011,90: 659 669.

[31]Liu Q,Luo G,Zhou X R,et al. Biosynthesis of poly(3-hydroxydecanoate) and 3-hydroxydodecanoate dominating polyhydroxyalkanoates by beta-oxidation pathway inhibitedPseudomonasputida[J]. Metab Eng,2011,13: 11-17.

[32]Wang H H,Zhou X R,Liu Q,et al. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate homopolymers byPseudomonasputida[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2011,89: 1497 1507.

[33] Yang Y H,Brigham C J,Song E,et al. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) containing a predominant amount of 3-hydroxyvalerate by engineeredEscherichiacoliexpressing propionate-CoA transferase [J]. Biochemical Engineering Journal,2012,113(4): 815-823.

[34]Tsuji H,Okumura A. Stereocomplex formation between enantiomeric substituted poly (lactide)s: blends of poly[(S)-2-hydroxybutyrate] and poly[(R)-2-hydroxybutyrate] [J]. Macromolecules,2009,42: 7263-7266.

[35]Park S J,Lee T W,Lim S C,et al. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoates containing 2-hydroxybutyrate from unrelated carbon source by metabolically engineeredEscherichiacoli[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2012,93: 273-283.