牙磨片的制作及苏木精－伊红染色法

高苏凤，姚丽艳，高美钦

牙体硬组织特别是牙釉质无机物含量很高[1]，用常规脱钙法制成牙切片，会使应有的组织结构遭到破坏，故采用磨片观察。而牙本质、牙骨质无机物含量较牙釉质低，有机物含量相对较高，要掌握其组织形态结构以及它们之间的关系通常是磨片和切片结合起来观察[2]，制作牙切片工序繁杂，耗时长[3]。为简化程序，提高牙磨片的观察效果，笔者尝试采用苏木精－伊红（H－E）染色法将不脱钙的牙片进行染色以提高染色效果[4]，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与设备 数码显微镜（BA 310Digital，麦克奥迪实业集团有限公司）；慢速手机（EX－203，日本精工株式会社）；电子数显卡尺（SIMCT，上海量具刃具厂）。甲醛溶液、苏木素、伊红Y、二甲苯、中性树胶等（国药集团化学试剂有限公司）；标准级显微镜载玻片、高品质显微镜盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标本选择和制作 收集新近拔除的下颌阻生第三磨牙，挑选牙体完整，牙合面无龋坏，根尖孔完全闭合的5颗，浸泡于10%甲醛溶液中1周，去净牙周软组织。取两片金刚石磨片中间夹一片垫片（直径7.5mm厚度0.6mm），固定在夹石针上，安装到有喷水装置的慢速手机直机头上。取一块白色泡沫在近边缘处，挖除略小于牙齿体积的小洞，将牙齿嵌压入，取牙冠的矢状面由牙尖处入手，左手固定，右手以掌拇指法握持手机柄，拇指以牙齿为支点，脚踏开关，稳固而缓慢地切割，将牙齿纵切成约0.6mm的薄片，挑选厚薄均匀，外形完好的牙片5片，放置粗油石上加铸磨粉在保持湿润状态下进行研磨，用电子数显卡尺测量厚度，磨至约0.3～0.4mm时，流动水冲洗干净，改用细油石研磨，边磨边滴水，使牙片表面的纹路消失，表面光滑、平整，磨薄至0.23～0.25mm厚度，流动水反复冲洗，滤纸吸干水分。

1.2.2 试剂配制

1.2.2.1 Harris苏木精染色液的配制 苏木素1g，无水乙醇10mL，硫酸铝钾20g，蒸馏水200mL，氧化汞0.5g，冰醋酸8mL。先用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，后将两液合并煮沸30s，加入氧化汞，搅拌后以冰水冷却，静置过夜，过滤备用。使用前加入冰醋酸并混匀。

1.2.2.2 伊红染色液的配制 伊红Y 2g，蒸馏水20mL，冰醋酸1～2mL，将伊红与蒸馏水混合溶解后滴加冰醋酸并搅拌呈黄红色糊状，过滤，弃去滤液。将沉淀物连同滤纸一起放入60℃温箱中干燥，95%乙醇400mL溶解伊红粉末。

1.2.3 H－E染色步骤

1.2.3.1 脱 蜡 二 甲 苯 Ⅰ 10min；二 甲 苯 Ⅱ10min；100%乙醇1～3min；95%乙醇1～3min；80%乙醇1～2min；70%乙醇1～2min；流水冲洗5～10min；蒸馏水1min。

1.2.3.2 染色程序 苏木精染液染色5～10min，流水冲洗1～5min，1%盐酸乙醇分化数秒。流水冲洗蓝化10～30min。伊红染液染色10～30s，常规脱水，中性树胶封固。

1.3 染色结果 牙釉质不着色，牙本质、牙骨质显示鲜明、艳丽的紫红色，与牙釉质形成明显对比（图1）。牙釉质的组织结构清晰，釉牙本质界处呈许多褐色相连的小弧形线，凸面向着牙本质，凹面向着釉质，釉丛形似草丛、釉梭形似纺锤状。在牙冠部牙本质近釉质牙本质界处见淡红色的不规则形状的球间牙本质，沿牙生长线分布，边缘呈凹形，像许多相接球体之间的空隙。牙本质由无数呈紫红色牙本质小管贯穿，走向明显，以牙髓腔为中心，向釉牙本质界呈S型放射状排列，近髓腔的第一个弯曲凸面朝向根尖部，第二个弯曲的凸面朝向牙冠，在牙尖和切缘处几乎呈直线，牙本质生长线颜色略深呈弯曲状与其垂直行走。牙本质小管横切面呈紫红色网管状。在牙根部的牙本质近牙骨质处见黑色小颗粒状的托姆斯颗粒层（图2）。牙骨质显示鲜明的红色，颜色较牙本质深，紧贴根部牙本质表面，自牙颈部到近根尖1／3显示红色的层板状结构而无细胞。在无细胞牙骨质表面和根尖及根分叉处，全部为细胞牙骨质，见黑色的卵圆形陷窝，表面有许多细小的突起向牙周膜方向伸展，层板结构较厚，平行排列的生长线相距较远。釉质牙骨质界在牙颈部相接，不着色的釉质与红染的牙骨质形成鲜明对比，牙釉质与牙骨质的连接情况清晰明了（图3）。

图1 H－E染色牙磨片图片Fig 1 Photograph of H－E staining teeth grinding

图2 牙纵断磨片 （H－E染色 ×400）Fig 2 Longitudinal grinding of teeth（H－E staining ×400）

2 讨 论

图3 牙纵断磨片 （H－E染色 ×100）Fig 3 Longitudinal grinding of teeth（H－E staining ×100）

掌握牙体组织结构特点是口腔组织病理学课程的重要内容，对于临床医疗和科研也具有较大的意义。如牙釉质的点隙龋，一旦龋病深入至釉牙本质界处，则很快向深部扩展，窝洞制备时应注意避免悬空釉柱的产生。牙本质是构成牙主体的硬组织，氟牙症和维生素D缺乏时球间牙本质明显增多。牙本质小管弯曲状的排列，牙髓发生病变时有可能与牙体硬组织的病变不在同一水平上，治疗时要估计到这种可能性。牙骨质内没有血管，其吸收力弱于骨组织的生物学特性，有助于达到正畸治疗的目的。常规的牙齿石蜡切片法，需脱钙变软后才能切片，牙体组织结构特别是牙釉质无机物含量高，经脱钙后，镜下只能观察为无色透明的一薄层，甚至见不到其痕迹，无法进行观察研究[5]。吴哲等采用MMA包埋技术，不脱钙的牙齿包埋后片切[5]，但存在操作麻烦、切片易与载玻片分离、皱褶碎裂等缺陷。笔者对传统牙磨片的技术方法进行改进，将牙体片切，磨薄后染色，操作简便、经济，可以同时显示牙体硬组织的组织结构特征。但牙髓等软组织的结构在制片过程中遭到破坏，因此尚需对技术进一步探讨。

由于牙釉质和牙本质钙化程度不同，有机物含量不一，选择新鲜的牙齿可以尽可能少地影响牙体的理化特性，保证制片的质量，在片切时不易使牙釉质和牙本质脱离，可以提高成功率。牙片磨薄的厚度，以0.23～0.25mm为最佳，且厚薄要一致、表面光滑无划痕，有利于着色均匀。牙片磨薄时，应根据手感辨别磨处的厚薄而施力，否则会出现釉质很厚，镜下观察不到清晰的结构，而牙本质已磨薄，甚至磨穿，过薄使应有的组织结构被磨去。操作时要整个手指指腹紧贴牙片，与油石成30°角。粗磨时加上铸磨粉在保持湿润状态下进行研磨可以提高效率，细磨时以水为介质，纵横交替研磨。

进行H－E染色时技术关键：（1）苏木素染色的时间。依据苏木精染液的成熟程度、磨片的厚薄、室温等而定，一般染5min。对于较厚的磨片相对要缩短染色时间。如染液使用时间较长或气温较低则需延长染色时间。（2）盐酸分化（将过度染色的或不需着色的组织成分上的颜色除去）程度的把握。分化不充分结构模糊不清，分化过度则对比度差。分化过程中应将磨片置于显微镜下观察控制，以达到背景清晰，牙本质小管呈紫红色。（3）蓝化是指用苏木素液染色后，通过盐酸分化，磨片从酸性环境中转移到流水中使之变蓝的过程。蓝化时间15～30min，并在显微镜下控制。如冲水不充分，因组织磨片有酸的成分存在，容易褪色，不利于磨片的保存。

[1]于世凤，孙宏晨，李 江，等.口腔组织病理学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2012：53.

[2]李 萍，宋 萍，魏 丹，等.学生自制牙体组织磨片在口腔组织病理学实验教学中的应用[J].遵义医学院学报，2007，30（3）：419－420.

[3]梁英杰，凌启波，张 威，等.临床病理学技术[M].北京：人民卫生出版社，2011：12.

[4]姚丽艳，赵 伟，吕红兵，等.3种脱钙液对牙体牙周联合切片H－E染色效果的对比[J].福建医科大学学报，2006，40（3）：298－301.

[5]程 敏，洪丽华，张泽兵，等.钟状晚期牙胚和牙及牙周组织的特殊染色应用探讨[J].实用口腔医学杂志，2008，24（2）：213－215.

[6]吴 哲，马冬丽，洪丽华，等.不脱钙的牙齿骨骼塑料包埋制片技术 及 方 法 探 讨 [J].华 西 口 腔 医 学 杂 志，2006，24（6）：564－565.