油松天然次生林居群遗传多样性及与产地地理气候因子的关联分析

李 明，王树香，高宝嘉

(1.河北农业大学生命科学学院，保定 071000;2.河北农业大学林学院，保定 071000)

油松(Pinus tabulaeformis Carr.)是我国特有树种，分布全国14个省(自治区)［1］，具有重要的生态、经济价值，是我国北方天然油松分布区的主要建群种，同时也是我国北方地区治理水土流失、改善生态环境的重要造林树种［2］。近年来，人们对油松天然林进行了大量利用，加之气候影响，大面积的油松天然林遭到破坏，甚至消亡。因而，迫切需要对油松天然林遗传资源进行保护，以防止其优良基因和遗传多样性丧失。在上世纪中后期徐化成等从形态特征、化学成分及分布特征等方面做了大量关于油松天然林的地理变异研究［3-5］，认为生长特性与纬度呈负相关，与年均温呈正相关，同时形态指标、抗逆指标又存在地理变异的不连续性，并对油松种源的20个特征进行了遗传变异研究，划分了7个生态型。在油松的分子遗传方面，张春晓、李悦等采用水平淀粉凝胶电泳方法研究了油松遗传多样性指数与海拔、年降雨量存在相关关系［6-7］;王磊等利用随机微卫星扩增多态性DNA(RMAPD)分子标记技术，揭示了油松各天然居群间存在较高遗传多样性差异［8］;李毳、柴宝峰等用酸性聚丙烯酰胺凝胶(APAGE)技术分析了华北地区油松居群在醇溶蛋白及分子水平的遗传特征［9-10］。近年来，李明、张静洁等采用ISSR标记技术对油松种质资源保护、遗传多样性与生境环境作了一定研究，认为不同海拔生境及土壤因子影响下，其天然次生林存在明显变异规律［11-12］;王孟本、Eckert等通过对不同居群油松与环境因子研究，认为不同油松居群间遗传分化显著，遗传多样性指数与年均温、年降雨量不存在显著相关性［13-15］。系统研究产地环境因子与油松天然次生林遗传变异的关联以及地理变异规律将对油松种质资源的保护和利用具有重要的理论意义。本研究采用ISSR技术对油松天然群体遗传多样性变异进行研究，据此分析其与产地生态环境因子的关联，从而更清楚地认识和预测天然油松次生林分子特征的地理变异规律，并为正确、合理利用与保护天然油松种质资源提供基础资料和科学依据。

1 研究地区与研究方法

1.1 野外取样

2011年7底到8月初，于河南、山东、河北、宁夏、山西、陕西、甘肃、辽宁等8省10地区的油松天然次生林中取样。每居群取25株个体，每两个体间距大于50 m，共250个样本。采集当年生新鲜针叶，将针叶放入保鲜盒中带回，置于-20℃冰箱保存。其中，经纬度、海拔由GPS测得，年平均气温、极端最高温、极端最低温、年降雨量、年日照时数等气象因子由各居群所在地气象站资料计算得到，各采样点位置及气象数据如表1。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取和反应体系

采用UNIQ-10柱式新型植物基因组DNA抽提试剂盒(购自上海生物工程有限公司)提取DNA，并稀释成终浓度20 ng/μL，放入-20℃冰箱储存备用。根据加拿大哥伦比亚大学公布的100条ISSR标记序列(http://www.biotech.ub.ca/services/naps/primers/Primers.pdf)，筛选出 13 个重复性好、特异性高的引物用于 ISSRPCR反应［12］，ISSR引物由上海生物工程有限公司合成。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后，在UVP凝胶成像系统下观察拍照。

1.2.3 数据统计和分析

以产生分子量为100—2000 bp的Marker DL2000(宝泰克)为标准谱带，有带记作“1”，无带记作“0”。假设群体处于哈迪-韦伯平衡，利用POPGENE 1.32和GENAlEX6.3软件对谱带进行遗传特征分析，分别计算:(1)观测等位基因数Na;(2)有效等位基因数Ne;(3)期望杂合度He;(4)Shannon信息指数I;(5)多态位点百分率P;(6)总基因多样度Ht;(7)居群内基因多样度Hs。

应用SPSS 18.0软件进行Pearson相关性分析，应用POPGENE软件以UPGMA法对居群间的亲缘关系进行聚类分析，并绘制聚类图。

2 结果与分析

2.1 油松天然居群遗传多样性

13个ISSR引物共扩增出137个多态位点，平均多态位点百分率60.72%，总的多态位点百分率100%，平均每条引物扩增10.54条谱带(表2)，绝大多数谱带集中在400—1600 bp(图1)。不同油松居群的总基因多样度(Ht)为0.3461，其中存在于居群内的基因多样度(Hs)为0.2162，居群间的基因多样度(DST)为0.1299。不同居群间的遗传分化系数(GST)为0.3753，表明大部分分子变异发生在居群内(62.47%)。一般风媒传粉的异交木本植物居群间变异占总变异的10%左右，油松与之相比，显然是偏高的。根据Nm=0.5(1-Gst)/Gst计算出不同生境下的油松居群基因流(Nm)为0.8323，说明居群间存在有限的基因交流。

表2 ISSR扩增引物、序列及扩增结果Table 2 ISSR primer labels，primer sequences and amplification results

图1 ISSR引物(826)对苏峪口居群部分个体的扩增结果Fig.1 The profiles of SDC population using the ISSR primer(826)

由表3可知，各居群间 Shannon信息指数变化范围在0.1923—0.2490，平均值(0.2165)与 Nybom［21］所统计的多种植物种群水平的遗传多样性(基于RAPD和ISSR等显性标记)平均值(0.22)相似;各居群间期望杂合度He变化范围在0.2824—0.3702，其中山西和顺云龙公园居群最高，甘肃冶力关居群最低，与观测等位基因数变化趋势基本一致;多态位点百分率以河南宝天曼油松居群最高(71.53%)，山西和顺云龙公园居群次之(70.7%)，甘肃冶力关居群最低(51.09%)。

表3 油松天然居群遗传参数Table 3 Genetic parameters of Pinus tabulaeformis populations

2.2 油松居群ISSR差异带数分析

10个油松天然居群中，13条引物扩增出差异带数最少为84条(DWP)，最多为127条(YLGY)，各油松天然居群扩增谱带及频率存在较大的变异。另外，在差异带数出现频率很低(≤25%)时，少数居群如YLG、SYK、DWP三居群没有扩增特异条带，说明三居群变异程度低;而YLGY居群有3条，YWL和LKS居群各有2条，其它居群各1条(表4)，说明这些油松天然次生林居群具有更丰富的变异基础。在使用的引物中，SDC居群有1条特异性扩增条带，为该居群种质资源的变异特性研究提供了重要前提。

表4 油松居群ISSR差异带数分析Table 4 Different bands for ISSR data of Pinus tabulaeformis populations

2.3 油松天然居群间的遗传距离和UPGMA分析

表5显示，10个天然油松居群间的遗传距离(D)变化范围为0.083(LKS-CJC)—0.2939(SDC-DWP)，地理距离变化范围为110.9252 km(LKS-SDC)—1741.0933 km(YWL-YLG)。经Mantel检验，10个居群间的地理距离和遗传距离不存在显著相关性(r=0.069，P=0.360)，说明地理隔离不是遗传变异的主要原因，而产地环境因子长期胁迫，可能使油松居群发生一定程度的地理适应性分化。

表5 油松居群间遗传距离(对角线下方)和地理距离(对角线上方)/kmTable 5 Nei's genetic distance(below diagonal)and geographic distance(above diagonal)/km of Pinus tabulaeformis populations

根据Nei无偏遗传距离构建居群间UPGMA聚类图(图2)显示，10个油松天然居群共聚成3大类:河南宝天曼(BTM)、承德大窝铺(DWP)、宁夏苏峪口(SYK)和甘肃冶力关(YLG)居群聚为一类，辽宁医巫闾(YWL)、山西沁源灵空山(LKS)、陕西蔡家川林场(CJC)、山西和顺云龙公园(YLGY)和山西汶水三道川林场(SDC)居群聚为一类，山东蒙山(MS)居群独立为一类。

图2 10个天然油松居群基于Nei's(1972)遗传距离聚类图Fig.2 Dendrogram based Nei's(1972)genetic distance of 10 Pinus tabulaeformis populations

2.4 油松天然居群遗传多样性及与产地环境因子相关性分析

进一步对油松天然居群遗传多样性与产地环境因子进行相关性分析(表6)，油松天然居群的观测等位基因数(Na)及多态条带百分率(P)与年平均气温、1月平均气温、极端最低温等产地气候因子呈显著正相关，与海拔呈显著负相关。Shannon信息指数(I)与海拔(r=-0.5788)、极端最高温(r=0.5289)及年降雨量(r=-0.5512)呈显著相关，即随着极端最高温升高、海拔降低、年降雨量减少，Shannon信息指数升高。

表6 油松居群遗传参数与环境因子相关性Table 6 The relationships between genetic diversity parameters of Pinus tabulaeformis populations and environmental factors

3 结论与讨论

3.1 油松天然居群的遗传多样性与环境因子相关性

油松居群的平均多态位点百分率60.72%，总的多态位点比率为100%，变异幅度范围为55.47%—71.53%，表明油松在种水平上具有较高的遗传多样性。Wright［17］认为居群间基因流大于1能发挥其均质化作用，反之，则表明基因流成为遗传分化的主要原因。本研究天然油松林的基因流为0.8323，说明不同产地环境的长期影响，可能造成天然油松居群间基因流较小，是居群间遗传分化重要原因。居群间遗传变异占总变异的37.53%，表明居群间已产生较大程度的分化。故表明居群间地理及环境因子的差异，可能使花粉的传播受到较大程度的阻碍，从而限制了居群间的随机交配，居群间遗传分化越来越明显。

本研究的目的之一是分析油松居群遗传多样性及与生态因子间相关性。13条引物扩增的多态条带比率非常高(100%)，在137个ISSR扩增谱带中，特有条带1条(山西三道川林场)，频率≤25%差异条带数量1—3条，频率≤50%差异条带数量7—24条，出现频率≥5%的差异带数76—125条，从而进一步说明作为分布于我国北方各省的广布种，天然油松次生林具有极丰富的基因多态性。一般认为一个物种的遗传多样性愈丰富，对环境变化的适应性就愈大［18］，油松天然居群间遗传结构的差异有利于油松提高抵御不良环境的能力，扩展其分布范围，增强其适应性。很多学者对不同植物居群进行了环境因子与遗传多样性指数间的相关性研究，发现居群遗传多样性与产地海拔、温度、降雨量、土壤矿物质含量等因子间存在一定的相关关系［16，19-24］，说明环境胁迫影响下，导致谱带频率和遗传多样性发生一定程度的梯度变化，引起相应的适应性生态地理分化。有大量研究［25-27］指出，植物抗寒性并非由单一基因控，是由多种特异的数量性抗寒基因调控的。本研究结果显示(表6)，随着产地年平均气温、极端最低温的降低，天然油松林居群的观测等位基因数量及多态位点百分率显著降低，Shannon信息指数与降雨量呈现显著负相关，从而说明低温和降雨量影响了抗逆相关基因数量的表达，对天然油松次生林ISSR多态性产生选择压力。这与借助RAPD、等位酶等标记技术对其它植物的研究结果相似［19-20，22-23］。总之，导致油松天然居群间遗传分化的原因除了与自然选择及居群间缺乏有效的基因流有关外，还可能与生物学特性及其它原因有关，故遗传分化—自然选择—生物学特性三者间关联性有待进一步研究探讨。

3.2 油松天然居群遗传多样性地理变异模式

20世纪七八十年代，徐化成等对油松生长、表型性状与地理-气候因素关系进行了系统研究，认为生长特性与年均温具有关联性，油松在形态学水平的地理变异具有随机性［1-5］。本研究从DNA水平研究得到不同结论，即产地气温、海拔和降雨量等产地气候因子是影响天然油松次生林遗传变异的重要环境因子，而不同经纬度产地的本质是其气候条件的差异，与产地气候因子相关也就意味着存在一定的地理模式，进而说明油松天然居群基因水平的地理变异并不是完全随机的，具有一定的规律性。基于UPGMA聚类分析显示，作为天然油松林分布中心的太行山脉、吕梁山脉及黄龙山脉的天然油松次生林相似性高，而分布于其它地域天然油松林具有一定的独立遗传特征。Shannon多样性指数(I)和多态位点百分率(P)可评价遗传多样性的高低，指数越大，表明居群的遗传多样性水平越高。山西和顺云龙公园、河南宝天曼及辽宁医巫闾居群的Shannon信息指数及多态位点百分率均较高，并地处中国地势二级和三级地势阶梯分界线附近，即油松天然居群分布区南北向中轴区域，故推测三居群与其它居群受季风影响种子及花粉交流相对频繁，基因多态性水平高;而山东蒙山、甘肃冶力关居群相对独立，说明该居群环境限制了与其它居群的交流，遗传特征独特，Shannon信息指数及多态位点比率均较低。由此进一步说明，油松天然居群遗传变异存在一定的地理变异模式。

森林树种应对环境胁迫表现出明显的表型适应性，而关于基因区域的中性标记是否作为植物适应性的选择始终具有争论，Neale和Kremer［28］认为，森林基因组学将为适应环境胁迫的功能基因的研究提供重要工具，研究结果将为适应性遗传变异的中性选择理论提供科学依据［29-30］。本研究结果借助随机性ISSR标记，说明不同环境胁迫下油松天然次生林群体多态性差异和遗传分化较大，反映油松天然居群一定的地理变异趋势，虽不能准确反映与当地环境适应的生长、抗性、形态等指标功能基因的变异趋势，但为中性标记的适应性选择理论提供了重要支持。

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