磷酸西格列汀干预糖尿病大鼠肾脏中VEGF的表达

郭燕羽 史丽萍

(河北联合大学附属开滦医院 河北唐山 063000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重的并发症，其发病机制尚未明确，早期就会出现肾脏微血管内皮细胞的损害，其发生、发展与血管内皮功能障碍和许多生长因子的异常表达密切相关［1］，而VEGF在DN中特异性的表达具有一定意义。积极寻找DN的有效药物，并在早期阶段就给予针对性的治疗，对控制和延缓肾脏病变的进展有重要意义。磷酸西格列汀属于DPP-Ⅳ抑制剂，是新一类降糖药。本实验研究显示，磷酸西格列汀对早期大鼠(DN)VEGF的表达具有影响性，从而为进一步探讨DN的发病机制和治疗理论提供了依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组 50只健康雄性SD大鼠，体质量200～220g，购于北京维通利华实验动物中心。随机抽取10只作为正常对照组(NC组)，其余40只经腹腔注射链脲佐菌素(str eptozotocin，STZ，剂量65mg/kg)。制备糖尿病大鼠模型，NC组给予等量的0.1mmol/L的柠檬酸缓冲液。72h后，尾静脉采血，用血糖仪测随机血糖连续3次均≥16.7 mmol/L者为糖尿病大鼠模型成立。造模过程中4只大鼠死亡，成功造模36只，并随机分为糖尿病模型组(DM组)和磷酸西格列汀治疗组(SP组)各18只;SP组给予磷酸西格列汀10mg/(kg.d)灌胃，其余两组给予等量生理盐水灌胃。

1.2 实验方法

1.2.1 生化指标的检测。分别于实验的3、6、8周末，NS组中随机抽取3只及其余两组中随机抽取6只，分别留取次日尿液、称体重、腹主动脉放血后处死。收集血、尿标本，检测血糖(GLU)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及24h尿蛋白定量(Upro)，用7180型号全自动生化分析仪检测。

1.2.2 常规光镜检查。解剖后取固定好的肾组织常规脱水、包埋，制成4～5μm的切片，经HE染色。

1.2.3 酶联免疫法测定VEGF。切割肾脏组织标本，经离心收集上清液备用，采用酶联免疫吸附方法检测VEGF，将纯化的VEGF抗体包被微孔板，制定固相抗体，将VEGF抗原加入包被单抗的微孔中，然后与HRP标记的VEGF抗体结合，加底物显色，用酶标仪在40nm波长下测定吸光度(OD值)，经计算得出实际浓度。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件处理，数据以(s)表示，各组间差异性比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各组动物造模后体质量、血糖的变化 实验的3、6、8周末与NC组比较，DM组和SP组大鼠体质量明显低于NC组(P＜0.01)，差异有统计学意义;与SP组比较，MD组大鼠体质量又低于SP组(P＜0.05)。同时各周末，DM组和SP组血糖明显高于NC组(P＜0.01)，其差异有统计学意义;而DM组和SP组血糖变化(P＞0.05)，差异无统计学变化，说明磷酸西格列汀较短时间内对糖尿病大鼠血糖的影响不大，见表1。

表1 各组大鼠体重、血糖的比较(s)

表1 各组大鼠体重、血糖的比较(s)

注:与NC组比较，#P ＜0.01，与SP组比较，▼P ＜0.05

组别 时间(周)例数(只)体质量(g)血糖(mmol/L)DM组SP组NC组

2.2 各组动物血肌酐、尿素氮及24h尿蛋白定量的变化 动物实验证明，3、6、8周末，DM组和SP组与NC组比较，血清中肌酐、尿素氮及24h尿蛋白定量值明显升高(P＜0.01);而SP组与DM组血肌酐比较明显降低(P＜0.05)，SP组与DM组尿素氮、24h尿蛋白定量比较明显降低(P＜0.01)，差异有统计学意义，动物实验证明，在糖尿病大鼠造模的初期就会出现糖尿病的肾损害，而磷酸西格列汀对于早期肾损害有一定保护作用，见表2。

表2 各组大鼠血肌酐、尿素氮及24h尿蛋白定量的比较(s)

表2 各组大鼠血肌酐、尿素氮及24h尿蛋白定量的比较(s)

注:与NC组比较，#P ＜0.01;与DM组比较，△P ＜0.05，*P ＜0.01

组别 时间(周)例数(只)Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)Upro(mg/24h)

2.3 光镜观察 肾脏HE染色:NC组肾小球结构正常，DM组大鼠随着病变周数延长，病变越严重，可见肾小球体积增大、系膜区增宽、肾小球基底膜增厚后，SP组与DM组同期相比病变程度有所减轻，见图1～3。

图1 8周末NC组(HE染色，400×)

图2 8周末DM组(HE染色，400×)

2.4 各组大鼠肾脏组织VEGF表达的情况 3、6、8周末，DM组及SP组与NC组比较，大鼠肾组织中VEGF明显升高(P＜0.01);而SP组与DM组比较明显降低(3周末P＜0.05;余P＜0.01)，差异有统计学意义，见表3。

图3 8周末SP组(HE染色，400×)

表3 组大鼠肾脏组织VEGF表达的比较

3 讨论

糖尿病(DM)已成为威胁人类的重大疾病之一，DN是糖尿病常见微血管并发症之一，也是终末期肾病的重要原因，其发病机制及治疗已越来越受重视。DN的病理改变最初为肾脏肥大、肾小球血流量增加，接着肾小球系膜细胞增殖、系膜细胞外基质增加、肾小球基底膜增厚，最后发展成为肾小球硬化［2］。VEGF是一种有效的血管形成和血管通透性诱导因子，促进内皮细胞增殖［3］。是肾血管病变中重要的血管活性因子，其异常的表达可能加重了微血管的渗漏和尿蛋白的漏出，导致肾脏的高滤过、基底膜增厚、系膜组织扩张、肾小球肥大，而大量蛋白的漏出又作为独立因素损伤肾组织，继而可通过观察VEGF的的表达情况，了解DN的发生发展过程。

二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidaseⅣ，DPP-Ⅳ)是与糖尿病十分相关的酶，CD26是白细胞分化抗原之一，具有独特的DPP-Ⅳ酶的活性，在肠道、肾脏均有高度表达［4］。在肠道中胰高血糖素样肽-1(glucagons-like-peptide-1，GLP-1)及GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽)，而这两种最重要的肠促胰岛素素可以有效地增强胰岛素分泌，维持餐后血糖的正常水平［5］，但是肠促胰岛素在肠道内很快被DPP-Ⅳ酶裂解，使其失去调节血糖作用。在肾脏中，长期高血糖状态使肾上皮细胞分泌CD26增加［6］，导致肾脏局部血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子及转化生长因子等的因子表达增加，刺激肾细末细胞增殖、系膜外基质沉积增加，进而导致肾小球基底膜增厚，引起肾小球病理变化，导致肾损害［7］。经研究发现磷酸西格列汀这种DPP-Ⅳ抑制剂，可抑制DPP-Ⅳ对肠促胰岛素的降解，从而间接增加胰岛素的分泌，最终达到调节血糖的目的［8］。本实验通过磷酸西格列汀药物干预治疗，观察VEGF在糖尿病肾病大鼠中的表达情况，证明DPP-Ⅳ一类药物，对早期糖尿病大鼠肾脏有一定保护作用，并能延缓其DN的进展。但是观察大鼠的血糖并没有见到显著变化，然而在实验过程中，发现随着周期的增加，血糖也有下降趋势，也同样启发血糖的变化是否与实验周期过短有关，还需不断深入研究。

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