奥拉西坦对大鼠弥漫性轴索损伤后学习记忆功能的影响

杨 鹏 鲁大双 邹国红 荣建民 费乐学

孙晓娟 韩东玲① 王秀艳① 孙亚惠① 李 云

(河北联合大学附属医院神经外科，①附属开滦总医院 河北唐山 063000)

弥漫性脑损伤(diffuse brain injury，DBI)是闭合性脑外伤的一种，是神经外科常见急症之一，病情严重，致残率及病死率均高［1，2］。DBI后神经损害不仅发生在损伤瞬间，且在其后的数分钟到数天内产生的继发性损伤也很严重［3，4］，幸存者通常有严重的运动功能障碍。此外，DBI伤后还可出现神经元延迟性死亡，从而导致患者长期学习记忆功能障碍，极大地影响了患者生活质量。奥拉西坦是近来治疗DBI的常用药物，其脑保护作用和促进神经功能恢复的作用已引起人们关注。本研究拟采用Morris水迷宫技术研究奥拉西坦对大鼠DBI后学习记忆功能的改善作用，旨在为治疗颅脑创伤患者提供新的理论基础和治疗途径，改善颅脑创伤患者的预后。

1 材料与方法

1.1 材料 选用鼠龄4个月左右，体质量约310～390g的雄性Wistar大鼠(由中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所提供)48只。所有大鼠均首先接受4天的定位航行训练，训练结束后将大鼠随机分为正常对照组(12只)、假手术组(12只)、脑损伤组(12只)和药物干预组(12只)，分别接受不同的试验措施，在试验结束后第14天再次进行水迷宫试验。

1.2 弥漫性脑损伤模型的建立 对脑损伤组和药物干预组大鼠根据Marmarou方法制作弥漫性脑损伤模型［5，6］。方法:于致伤前0.5h，经腹腔注射阿托品(30mg/kg)。以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉动物，以75%酒精消毒术区，沿正中矢状线切开头皮，剥离骨膜，显露冠状缝及人字缝，固定打击垫片在大鼠冠状缝与人字缝之间，将大鼠俯卧位固定于海绵床垫(10×10×20)cm3上。头部固定于致伤架下，打击锤自2m高度自由落下，打击后即刻移开大鼠，以防止打击锤造成的二次损伤。致伤后，去除打击垫片，清创缝合伤口。保温复苏后继续饲养。

药物干预组大鼠在脑损伤后30分钟即刻经腹腔注射奥拉西坦(200mg/kg/d)。正常对照组、假手术组及脑损伤组在相同时间内给予等量生理盐水腹腔注射。之后每天于同一时间注入等量药液或生理盐水。假手术组仅给予麻醉及头皮切开、缝合，但不致伤。正常对照组不做任何处理。

1.3 Morris水迷宫测试

1.3.1 Morris水迷宫装置。水迷宫为直径120cm，高50cm的圆形水池，水深30cm，水温保持(26±1)℃，水中倒入速溶奶粉1袋，使水变为乳白色以减少大鼠视觉对记忆实验的影响。池壁上标有东南西北4个入水点，它们将水池等分为四个象限，分别称西南象限(SW)、西北象限(NW)、东南象限(SE)及东北象限(NE)，在SW象限正中离池壁33cm处放一个直径为9cm，高29cm的圆形透明平台，平台顶低于水面1cm，平台所在象限称为靶象限。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，摄像机与电脑显示系统相连。同步记录大鼠运动轨迹。训练期间迷宫外参照物保持不变。

1.3.2 Morris水迷宫测试方法。本试验分为两个部分。首先是定位航行训练及试验的准备，实验历时4天。第1天让大鼠自由游泳2min，从第2天起，每天分上、下午2段，每段训练4次，训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间，4次训练大鼠分别从4个不同的入水点入水。如果大鼠在180s内未找到平台，需将其引至平台。每次训练间隔60s。经过4天的训练后大鼠都能顺利在180s内找到平台。

训练完成后将大鼠随机分成4组，即正常对照组、假手术组、脑损伤组和药物干预组。分别进行相关试验措施后于第14天进行空间搜索试验，将大鼠面向池壁，随机选择一个入水点放入池中，记录大鼠在180s内搜索平台的次数、第1次穿过平台的时间及在靶象限活动时间。

1.4 数据收集 Morris水迷宫［7］测试计数基于个人电脑的软件。将一次试验中记录到的实验动物在每一帧图像中的位置以及位置对应的系统时间保存为一个文本文件。在一次实验结束后，可以据此计算大鼠在180s内搜索平台的次数。

1.5 统计学处理 实验中所得计量数据均用均数±标准差(s)表示，经Excel数据库整理后应用SPSS 11.0统计软件，计量资料进行t检验或方差分析，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般资料 48只Wister大鼠月龄4～5月，平均月龄(4.5±0.8)月，体质量(312～391)g，平均(350±20)g。随机分为4组后，不同组之间大鼠月龄、体质量分布均无统计学差异。

2.2 Marmarou弥漫性脑损伤模型复制 共对24只Wister大鼠进行Marmarou弥漫性脑损伤模型复制。致伤后均出现呼吸抑制和心跳暂停，给予吸氧、人工呼吸、心脏胸廓按压等抢救措施后，有9只呼吸心跳未能恢复，于伤后l小时内死亡，存活大鼠15只，病死率为37.5%。所有致伤大鼠伤后均出现四肢剧烈抽搐，持续15～30秒。随后，前肢呈去皮层屈曲，昏迷状态，多于30秒内恢复心跳和自主呼吸。存活大鼠于5～60分钟内清醒，前肢恢复正常。致伤大鼠在72h内反应迟钝，而正常对照组和假手术组大鼠活动正常。

2.3 空间搜索试验中不同组大鼠搜索安全岛次数比较 在脑损伤后第14天对4组大鼠进行Morris水迷宫测试，见图1。

图1 不同组大鼠搜索安全岛次数比较

由图1可见，伤后第14天，正常组大鼠搜索安全岛的次数(10.1±1.9)次与假手术组(10.3±1.8)次无明显差异。脑损伤组(3.8±2.3)次和药物干预组(6.3±1.3)次搜索安全岛次数明显少于正常组和假手术组，差别有统计学意义。药物干预组搜索安全岛次数高于脑损伤组，差别有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 空间搜索试验中不同组大鼠第1次穿过平台时间及在靶象限活动时间比较 在空间搜索试验的180s内，不同组大鼠第一次穿过平台平均时间及在靶象限活动平均时间见表1。正常对照组和假手术组大鼠在空间搜索试验中第一次穿过平台的平均时间均低于脑损伤组和药物干预组大鼠，差别有统计学意义;此外脑损伤组大鼠第一次穿过平台时间高于药物干预组，差别有统计学意义。不同组大鼠在靶象限活动时间结果与第一次穿过平台结果相似。

表1 不同组大鼠第一次穿过平台时间及在靶象限活动时间比较( s，s)

表1 不同组大鼠第一次穿过平台时间及在靶象限活动时间比较( s，s)

注:与正常对照组和假手术组比较，*P＜0.05;与脑损伤组比较，#P＜0.05

次穿过平台时间 在靶象限活动时间正常对照组(n=12)组别 第1＜0.001 ＜0.001 4.62±0.58 123.51±5.91假手术组(n=12)5.28±0.71 118.28±5.10脑损伤组(n=7)10.15±1.35* 61.38±8.67*药物干预组(n=8)7.68±1.09*# 89.14±7.68*#F 68.42 73.89 P

3 讨论

学习和记忆是属于高级神经活动或脑的高级功能，它是高等动物和人类最具特色的生理特征之一。Livesey等［8］应用电损毁法先后证明，海马CA1区与分辨学习有关。因此，利用损伤海马观察对学习和记忆的影响成为一个行之有效的研究方法。而Marmarou弥漫性脑损伤模型［9，10］的损伤部位即包括海马区域。Morris水迷宫实验一种让实验动物学习寻找不透明水中的隐藏平台的操作过程。该实验自英国科学家Morris于1981年首次设计使用以来，已经成为一种研究空间学习和记忆的标准模式。本研究采用了Marmarou弥漫性脑损伤模型和Morris水迷宫［11］技术，研究结果客观可靠。

DBI后损伤神经损害不仅发生在损伤瞬间，且在其后的数分钟到数天内的继发性损伤也很严重。Conti［12］等对脑外伤后大鼠的细胞凋亡研究发现，大鼠脑外伤后细胞凋亡高峰出现于伤后48h，这种伤后神经元的延迟性死亡，可导致长期学习记忆功能障碍。本研究也发现在采用Marmarou方法建立大鼠弥漫性脑损伤模型后14天，脑损伤组大鼠搜索安全岛次数和在靶象限内活动时间明显低于正常对照组和假手术组大鼠，而第一次穿过平台时间高于非损伤组，差异均有统计学意义，进一步证实弥漫性脑损伤后迟发性细胞死亡对大鼠学习记忆功能有一定影响，同时也提示我们，在临床上应尽量减少DBI后的迟发性细胞死亡，从而减轻脑损伤后的学习记忆障碍。此外，本研究中正常对照组大鼠和假手术组大鼠在实验第14天搜索安全岛次数的差异无统计学意义，因此可以排除头皮切开等应激反应对大鼠水迷宫试验结果的影响。

奥拉西坦是一种γ氨基丁酸衍生物，通过促进脑细胞生物能量代谢作用，提高脑组织内与精神行为相关的整合能力，从而恢复学习能力及增强记忆力。国内外临床研究表明，奥拉西坦对改善痴呆患者的学习记忆和认知能力方面有明显疗效，但对颅脑损伤所致的智能障碍和记忆力减退等方面的疗效研究报道极少。本研究结果发现，药物干预组大鼠在180s内找到安全岛的次数和在靶象限内活动时间明显高于脑损伤组大鼠(P＜0.05)，第一次穿过平台时间明显低于脑损伤组(P＜0.05)，这提示我们，奥拉西坦可有效改善大鼠脑损伤后学习记忆能力。其可能机制如下:在受外伤的影响下，一些临床常用促脑细胞复活的药物更难通过血脑屏障，奥拉西坦在应激环境中可选择性作用于脑干网状结构胆碱能神经元，提高脑代谢率，此外，奥拉西坦还可增加磷酰乙醇胺及磷脂胆碱合成数量，使海马部、大脑皮质处乙酰胆碱转运速率提高，同时提高脑磷酯酶A1活性度，减少脑磷脂分解速度，提高脑内ATP储存，继而特异性改善中枢神经系统功能。

本研究结果提示我们在弥漫性脑损伤后应尽早使用促进学习记忆功能的药物，以改善患者的预后。

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