乳源免疫调节肽体外抑制人卵巢癌细胞侵袭和转移

魏 彩，秦宜德，郑 欣，何晓光，张文晓，杨浩然

(安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室，安徽 合肥 230032)

卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，尽管发病率低于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位［1］。目前发病早期的手术切除依然是根治卵巢癌的主要方法，但术后也极易复发。虽然手术方式和化疗方案的选择都有些进展，但是卵巢癌的治疗并无实质性的突破。顺铂(cisplatin，cis-diaminodichloroplatinum，DDP)是目前临床上治疗卵巢癌的一线化疗药物，因其抗肿瘤效果确切，且新的铂类抗肿瘤药物虽然毒副作用略低于顺铂，但价格昂贵，药效也不能够完全替代顺铂等原因，临床仍将其作为一线药物［2］。然而顺铂有巨大的肾毒性、耳毒性等毒副作用也是不争的事实。那么寻找高效、低毒、价廉的替代药物是研究人员面临的又一新的课题。

乳源生物活性肽是乳蛋白经消化酶的作用后释放的一种肽，机体可以直接吸收，在免疫、代谢等诸多方面对生物体有调节作用［3－4］。且一些乳源生物活性肽还具有抗癌作用，显示在癌症治疗方面有广阔的前景［5－6］。本实验所用免疫调节肽是从牛酪蛋白酶解产物中分离出的六肽(Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn，PGPIPN)位于β-酪蛋白的63～68残基上，是较具代表性的免疫调节肽［7－9］。

本实验室前期研究结果发现，PGPIPN可以抑制卵巢癌细胞SKOV3细胞的生长并诱导其凋亡［10］。然而对PGPIPN是否有抗人卵巢癌细胞侵袭和迁移的能力，尚未见到资料报道。本研究旨在探究乳源免疫调节肽对人卵巢癌细胞侵袭和迁移的作用，并与传统抗癌药物－顺铂进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人卵巢癌细胞株(人卵巢浆液性乳头状囊腺癌，SKOV3)，人正常肝细胞株(LO2)，小鼠永生化成纤维细胞株(MEFS)由本实验室留存。

1.1.2 材料、药品 乳源免疫调节肽(PGPIPN)由上海生工公司合成，纯度为0.99以上。RPMI 1640细胞培养基购自Gibco-BRL公司，小牛血清购自杭州四季青公司，顺铂注射液购自江苏豪森药业公司，人工重建基底膜材料Matrigel为BD公司产品，孔径为8 μm的Transwell小室为Coster公司产品。常规生物化学试剂购自上海生工生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药品配制 顺铂注射液原药浓度为5.0 g·L－1，使用前用1 ml的注射器抽取0.1 ml用无血清的培养基稀释成0.5 g·L－1，剩余药液4℃冷藏。乳源免疫调节肽用无血清的培养基稀释成1.0 g·L－1，0.22 μm 滤膜过滤，5 ml EP 管分成小包装，－20℃以便长期保存。

1.2.2 细胞培养 细胞株 SKOV3、LO2和 MEFS均用RPMI 1640培养液培养，待生长至对数期后用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化传代，进行后续实验。

1.2.3 Transwell小室侵袭实验 将 Matrigel用不含小牛血清的培养液以1∶4稀释，取60 μl滴入Transwell小室底部膜，轻轻摇晃使其将底膜覆盖完全，在无菌环境中使其自然风干。接着加入含2 g·L－1BSA的无血清RPMI 1640培养液40 μl润湿20 min。取对数生长期的细胞，消化、离心后加入不含小牛血清的RPMI 1640培养基。细胞计数使每毫升约3×105个，取200 μl悬液加入细胞小室的上室，下室加入500 μl含小牛血清的RPMI 1640培养液，下层培养液和小室间避免有气泡产生，并观察Transwell小室膜的完好性。每组3个复孔，培养，分别于24、30、36 h时取出上室，并轻轻擦去小室内侧细胞，甲醛固定2 min，苏木精染色10 min，水洗，伊红染色10秒，水洗，剪下底层膜，于载玻片上用中性树脂固定，显微镜下观察细胞侵袭率，选定最佳培养时间。正式实验时，同样取200 μl细胞悬液分别加在24孔Transwell小室的上室，设定好PGPIPN组、顺铂做阳性对照组加入不同浓度的药物，并在空白对照组再加入与药物同体积的不含小牛血清的RPMI 1640培养液，培养。于最佳培养时间时取出，与之前实验一样，最后用显微镜观察，选5个视野计数、拍照。

侵袭抑制率/%=(1－实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100%

1.2.4 细胞划痕实验 取对数生长期的细胞按每孔5×104个细胞数加入12孔培养板中，过夜，待细胞完全贴壁后，用200 μl的移液器枪头，在12孔培养板每孔的中央在纵轴方向划线。用PBS洗细胞2次，去除刮起的漂浮细胞，加入含或不含药物的无血清培养基，放入培养箱培养，在0、12、24 h分别于倒置相差显微镜下观察并拍照。实验用Photoshop 7.0软件对细胞的迁移距离进行测量，分别测5条线的宽度，取其平均值。实验设无用药对照组和各种不同浓度PGPIPN的实验组，以及顺铂做阳性对照组，每组5个复孔。

迁移抑制率/%=(1－实验组迁移距离/对照组迁移距离)×100%

1.2.5 克隆形成实验 细胞生长至对数期时，以2.5 g·L－1胰蛋白酶消化、制备含体积分数为0.1的小牛血清的单细胞悬液，细胞计数板计数活细胞数。调整细胞密度，使每孔500 μl，分别接种每孔1 500、1 000、750、500、250、100 个细胞于 12 孔培养板中。十字摇匀，每个浓度设5个平行样本，隔2 d换新鲜含药培养液，培养10 d，计数克隆形成率。继续培养至12 d观察细胞生长情况。选取最佳细胞个数，继续PGPIPN组以及顺铂做阳性对照组的同样的实验。实验结束后，选取培养后的细胞计数＞30个细胞的克隆，计算克隆抑制率。

用药组克隆抑制率/%=1－(用药组形成的克隆数/空白对照组形成的克隆数)×100%

1.2.6 MTT法检测PGPIPN的细胞毒性 用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化并收集处于对数生长期的SKOV3细胞，调整细胞密度，接种至96孔培养板中，每孔100 μl，置于细胞培养箱中培养过夜。次日，等大部分细胞贴壁后，每孔分别加入不同浓度的PGPIPN，以顺铂做为阳性对照，每孔100 μl，每一浓度设5个复孔;空白对照组加入等体积的培养液，继续培养24、48、72 h。每孔加入 MTT 液(5.0 g·L－1)20 μl，继续培养 4 h，吸弃上清液，每孔加入 DMSO 100 μl，振荡混匀 10 min，在酶联免疫检测仪上于490 nm波长处检测每孔的吸光度(D)值，计算5个孔的均值。按以下公式计算细胞死亡率(inhibition percentage，IR):

另用正常人肝细胞LO2，正常小鼠成纤维细胞MEFS以同样的方法做为对照。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0软件对结果进行分析，计量资以±s表示，各组间均数比较采用配对资料的t检验并进行分析。

2 结果

2.1 Transwell法实验PGPIPN对SKOV3侵袭能力的影响 不同浓度PGPIPN对SKOV3侵袭能力的影响，见Fig 1～4。在未加药时，接种同种数量的细胞(2×105)在24、30、36 h时穿过小室的情况如下:在24 h时细胞穿过小室膜的数量较少，30 h时细胞穿过小室的数量明显增多，36 h时细胞的数量虽然有所增加，但已不如前者明显，说明细胞已基本全部通过小室膜。所以实验选取培养30 h作为最佳实验时间。结果可知(Fig 4)，与空白组相比，PGPIPN在 0.1、1、10 mg·L－1时对细胞的侵袭有明显抑制作用(P＜0.01)，尤其在 10 mg·L－1，抑制率达到23.78%。但其抑制效果不及同浓度的顺铂组。

2.2 细胞划痕实验测定PGPIPN对SKOV3运动能力的影响 运用细胞划痕实验检测不同浓度PGPIPN处理SKOV30、12、24 h后对细胞迁移的影响，实验用Photoshop 7.0软件对细胞的迁移距离进行测量，分别测5条线的宽度，取其平均值，结果见Fig 5和Tab 1。根据结果，PGPIPN能明显抑制卵巢癌细胞的迁移，而且有剂量依赖性。其中在PGPIPN作用24h，与对照组相比，10mg·L－1的PGPIPN抑制率达到56.24%，即使在低浓度0.1 mg·L－1时抑制率也有40.40%，其抑制效果略低于顺铂。

Fig 1 Effect of SKOV3cell migration ability for 24 h in transwell chamber model(×100)

Tab 1 Effect of SKOV3cell migration ability at different time points in cell scratch assay(±s，n=5)

Tab 1 Effect of SKOV3cell migration ability at different time points in cell scratch assay(±s，n=5)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative control

group Dose/mg·L－1 Migration distance/cm 12 h 24 h Inhibitory percentage/%12 h 24 h Negative control － 1.92 ±0.08 5.05±0.19 － －PGPIPN 0.1 1.69 ±0.08 3.01±0.13 11.98 ±0.66* 40.40 ±1.78＊＊1 1.33 ±0.07 2.53±0.08 30.73 ±1.78＊＊49.90 ±1.92＊＊10 1.03 ±0.06 2.21±0.09 46.35 ±1.91＊＊56.24 ±1.93＊＊Positive control 0.1 1.02 ±0.02 1.81±0.03 41.67 ±2.01＊＊64.16 ±2.06＊＊(DDP) 1 0.70 ±0.02 1.12±0.03 63.54 ±2.23＊＊77.82 ±2.33＊＊

2.3 细胞克隆形成实验测定PGPIPN对SKOV3细胞增殖能力、侵袭性的影响 分别为1 000、750、500、250个细胞接种后克隆率分别为12.23%、7.91%、6.29%、4.75%，各组克隆形成率差异均有显著性(P＜0.05)，见Fig 6。接种每孔100个细胞的一组未见明显的细胞克隆形成，接种每孔1 500个细胞的一组细胞均已融合，难以分辨形成的克隆，接种每孔1 000个者克隆形成率最高，所以实验选取接种每孔1 000个细胞。如Fig 7所示为不同浓度的PGPIPN作用于细胞后克隆形成情况。

2.4 MTT法测定PGPIPN对SKOV3细胞的毒性试验 运用MTT法检测不同浓度PGPIPN、DDP处理 SKOV3、LO2 、MEFS，24、48、72 h 后对细胞生长的影响。PGPIPN在高浓度下对SKOV3细胞的生长具有较强的抑制作用，同时对LO2、MEFS细胞的影响无统计学意义。DDP对SKOV3细胞的生长有抑制作用的同时，对LO2、MEFS细胞的影响也较大。如Tab 2所示为不同浓度的PGPIPN、DDP分别对SKOV3、LO2、MEFS 细胞生长的影响。

Fig 2 Effect of SKOV3cell migration ability for 30 h in transwell chamber model(×100)

3 讨论

本实验结果发现，人卵巢癌SKOV3细胞株经PGPIPN作用后，其侵袭和转移能力明显降低，且浓度越高则降低作用越明显。Transwell法中，30 h时PGPIPN组的10 mg·L－1抑制率为23.78%，在划痕试验、细胞克隆试验中均发现有明显的抑制作用。MTT实验中发现，PGPIPN对SKOV3具有明显的抑制作用，这与李素萍等［10］的实验结果相一致，同时PGPIPN对正常人肝细胞LO2，小鼠永生化成纤维细胞株MEFS的生长无抑制作用，且PGPIPN对LO2的生长似乎有促进作用，但差异无统计学意义。

肿瘤转移包括诸多环节，如何穿越生物学屏障是肿瘤细胞侵袭和转移动态过程的关键步骤［11］。

Tab 2The effect of SKOV3cell grow ability in MTT assay(±s，n=5)

Tab 2The effect of SKOV3cell grow ability in MTT assay(±s，n=5)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative control

group Dose/mg·L－1 SKOV3inhibitory percentage/%24 h 48 h 72 h LO2 inhibitory percentage/%24 h 48 h 72 h MEFS inhibitory percentage/%24 h 48 h 72 h Negative control－－－－－－－－－－0.001 3.48 ±2.11 5.47±3.12 8.29 ±3.99 －0.37±0.32 1.78 ±1.31 －1.11 ±0.97 0.57 ±0.50 1.78 ±1.43 1.56 ±1.33 0.01 5.34 ±2.92 8.67±3.29 13.85 ±3.41＊＊ 2.66±2.33 －0.93 ±0.84 1.24 ±1.07 1.34 ±1.22 0.45 ±0.43 1.78 ±1.74 PGPIPN 0.1 10.22±2.61* 13.24 ±3.18＊＊ 20.27±3.37＊＊ 1.23 ±1.39 0.56±0.42 0.23±0.22 1.89±1.54 1.23±1.21 2.56±2.52 1 16.44±2.23＊＊ 23.37±3.19＊＊ 27.54±3.89＊＊ －0.56±0.51 1.22±1.21 －0.56±0.47 1.13±1.11 1.27±1.20 0.34±0.46 10 20.91±2.35＊＊ 30.23±2.67＊＊ 32.36±3.11＊＊ 1.89±1.52 －1.13±1.01 －1.89±1.54 0.23±0.21 1.89±1.57 0.88±0.92 Positive control 0.01 12.23±2.77＊＊ 28.09±2.43＊＊ 32.34±3.31＊＊ 10.28±3.34* 21.03±3.78＊＊ 30.52±3.23＊＊ 9.93±2.89* 23.34±2.37＊＊ 29.89±3.20＊＊(DDP) 0.1 21.13±2.67＊＊ 43.49±3.45＊＊ 48.26±3.56＊＊ 18.56±3.45＊＊41.29±3.06＊＊ 47.53±3.53＊＊22.45±2.33＊＊ 44.34±4.43＊＊ 48.56±3.41＊＊1 33.56±2.93＊＊ 54.23±4.32＊＊ 65.22±3.67＊＊ 31.03±3.30＊＊53.66±3.78＊＊ 65.11±3.57＊＊31.79±2.72＊＊ 49.53±3.79＊＊ 61.23±4.22＊＊10 44.35±3.31＊＊ 64.76±3.76＊＊ 79.89±4.32＊＊ 45.48±3.43＊＊59.57±4.03＊＊ 76.76±3.50＊＊41.76±2.99＊＊ 61.45±3.44＊＊ 78.89±4.57＊＊

其中，细胞外基质(extracellularmatrixc，ECM)是肿瘤侵袭和转移的天然屏障，ECM的降解是肿瘤转移的一个关键步骤［12］。肿瘤细胞所具有的迁移性、分泌各种水解酶、黏附性等特点都与ECM密不可分。在肿瘤细胞产生并分泌多种水解酶中，包括各种蛋白水解酶，这些水解酶可破坏ECM。另外，肿瘤细胞的黏附性是与其产生的黏附分子有关，各种黏附分子皆为细胞表面的跨膜糖蛋白，能够与同种或异种黏附分子相结合并产生一定的生物学效应。因此，PGPIPN抑制癌细胞侵袭和转移的可能机制:PGPIPN作为一种信号分子与肿瘤细胞受体结合，通过影响相关蛋白质或酶的含量和/或活性，从而影响细胞的侵袭和转移行为，具体机制还有待进一步研究。

Fig 3 Effect of SKOV3cell migration ability for 36 h in transwell chamber model(×100)

Fig 4 Effect of SKOV3cell migration ability in transwell chamber model

在实验中发现，同浓度的顺铂组对SKOV3的抑制率均比PGPIPN组的高，同时也发现顺铂对正常

Fig 5 Effect of SKOV3cell migration ability at different time points in cell scratch assay (×100)

Fig 6 Clonogenic effect diagram (×100)

Fig 7 Effect of SKOV3cell colony formation ability in colony experiment

在实验中发现，同浓度的顺铂组对SKOV3的抑制率均比PGPIPN组的高，同时也发现顺铂对正常细胞LO2和MEFS同样具有很高的抑制作用。所以，PGPIPN虽不如顺铂的作用明显，但是PGPIPN来源于乳，对抗癌细胞的同时，对正常细胞无损害也是其一大优势，这在MTT实验中可以得到证实;其次，PGPIPN原料来源广泛，一旦研制出大规模生产的方法，可以大大降低成本，能够为肿瘤患者减轻经济负担。

PGPIPN对卵巢癌细胞株SKOV3的侵袭和转移的作用在本实验中得到证实，加之其他人员的研究结果可知PGPIPN有望成为抗肿瘤家族中的新成员。同时，如果大规模生产的方法能够早日实现，那么将会为肿瘤患者带来更大的福音。

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