何氏加味定喘汤对慢性支气管炎大鼠内皮素-1及肺组织形态学的影响

周运海,杨 洋

(苏州市中医医院,江苏苏州215000)

本实验通过观察实验性慢性支气管炎大鼠血清、肺组织匀浆中ET-1及肺、支气管组织病理形态学的改变,探讨何氏加味定喘汤对慢性支气管炎的治疗作用。

1 实验材料

1.1 动物 60只清洁级健康SD大鼠(SPF):苏州大学动物中心提供。

1.2 药物 何氏加味定喘汤(煎剂):由百部、炙麻黄、桑白皮、杏仁、炙紫菀、白前、制半夏、橘红、苏子、黄芩、象贝母、炙款冬花、炙地龙组成,棕色水煎剂,4℃贮存;止嗽合剂,由苏州市中医医院制剂室生产提供。

1.3 试剂及仪器 ET-1放免试剂盒由北京华英生物技术研究所提供,批号:20110525。XHF-D内切式匀浆机由上海京工实业有限公司生产。

2 实验方法

2.1 造模及给药 除空白对照组外,其余各组用烟熏法造模。造模参照文献[1]法,采用改良烟熏法复制:1)将造模组大鼠共42只置于90 cm×60 cm×60 cm的烟室中,烟室上方开一0.4 cm×60 cm的缝隙,下面外接回活塞通气管具。通气管具活塞端接烟条,后端接50 mL注射器。2)将锯末、旱烟条各12 g混合均匀,卷成每支8 g左右的烟条。将烟条接在活塞端,点燃烟条,抽动活塞即可顺利通入。3)烟熏大鼠:共30 d,其中前20 d每日2次,每次30 min,每次用烟条3支,每隔10 min加入1支;后10 d每天1次,方法同上。4)第20天时,取模型对照组大鼠2只。断颈处死,取右肺中部组织在福尔马林中固定,再经过脱水、浸蜡、包埋等处理,切片,常规HE染色做成病理切片光镜下观察,证明慢性支气管炎已经形成,造模成功。5)从造模第20天起,空白对照组及模型对照组用生理盐水1 mL/100 g,给药组按1 mL/100 g灌胃,阳性对照组用止嗽合剂5 g/(kg·d)灌胃,何氏加味定喘汤高、中、低剂量组分别以 20 g/(kg·d)、10 g/(kg·d)、5 g/(kg·d)剂量灌胃,各组均为每日 1次。各组均用药20 d。

2.2 检测方法 血清制备:术前8 h禁食不禁水,末次给药1 h后,称重大鼠,用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉。剪开腹部皮肤,纱布保护拨开腹腔内容物,暴露腹后壁,钝性分离腹主动脉,抽取腹主动脉血5 mL,4℃,制备血清,-20℃冻存待检;另抽取腹主动脉血2 mL,4℃,放入真空采血管EDTA抗凝管,制备血浆,-20℃冰存待检。

肺组织匀浆的制备:将左侧肺组织用冰生理盐水冲洗,滤纸吸湿后,称取湿重0.3 g左右,加入预冷的生理盐水,用电动匀浆器制成10%的肺组织匀浆,4℃,6 000 r/min离心5 min,提取上清液,-20℃冻存待检。

肺病理组织制备:取左侧肺脏中部组织0.5 cm×0.5 cm,用福尔马林溶液固定,待检。

检测方法:采用放免法测定大鼠血浆及肺组织匀浆中ET-1的含量,样本冷冻快递至北京华英生物技术研究所,由该研究所负责检测。肺组织切片,HE染色,光镜观察肺与支气管的组织形态学变化。

3 结果

3.1 何氏加味定喘汤对慢性支气管炎大鼠血清、肺组织匀浆中ET-1含量的影响 见表1。

表1 何氏加味定喘汤对慢性支气管炎大鼠血清、肺组织匀浆中 ET-1的影响(±s,n=10)

表1 何氏加味定喘汤对慢性支气管炎大鼠血清、肺组织匀浆中 ET-1的影响(±s,n=10)

注:与正常对照组比较:#P<0.05,##P<0.01;与模型对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01。

组 别 血清ET-1/(pg/mL)肺组织匀浆ET-1/(pg/mL)正常对照组 54.96±6.89 22.80±2.12模型对照组 105.88±11.17## 28.34±3.30#何氏加味定喘汤低剂量组 90.14±10.97## 26.08±3.41何氏加味定喘汤中剂量组 76.18±10.29△# 25.67±4.27何氏加味定喘汤高剂量组 61.16±6.07△△ 22.20±4.06△阳性对照组(止嗽合剂) 68.11±8.25△△ 23.11±3.88

3.2 何氏加味定喘汤对慢性支气管炎大鼠肺与支气管组织形态的影响 实验结果显示:慢性支气管炎大鼠支气管纤毛柱状上皮变性、坏死脱落,再生的上皮杯状细胞增多,并发生鳞状上皮化生;管壁平滑肌断裂、萎缩,管壁充血水肿,淋巴细胞、浆细胞浸润;支气管管腔变狭窄,炎症向管壁周围组织及肺泡扩展。何氏加味定喘汤随着剂量的增加,其病理改变程度逐渐减轻。何氏加味定喘汤低剂量组大鼠仍有支气管纤毛柱状上皮变性、坏死脱落现象;管壁平滑肌断裂、萎缩,充血水肿,淋巴细胞、浆细胞浸润程度较模型组均有所减轻;何氏加味定喘汤中、高剂量组支气管管壁平滑肌均很完整,管壁充血水肿现象还存在,淋巴细胞、浆细胞浸润明显减轻(见图1)。

4 讨论

慢性支气管炎多属中医的“咳嗽”“喘证”“痰饮”范畴。[2-3]慢性支气管炎病情虽复杂,证型变化颇多,但李鸿娟主任认为临床上最常见的只有3个证型,包括痰热蕴肺型,脾肾两虚、痰浊阻肺型,脾肾阳虚型,其他证型在此3型的基础上辨证,处方灵活加减运用,就可举一反三,执简驭繁了[4]。定喘汤出自《摄生众妙方》,全方由麻黄、白果、苏子、黄芩、半夏、桑白皮、杏仁、款冬花、甘草等9味组成,具有清肺降气、清热化痰功效,是治疗风寒外束、痰热内蕴之喘证的代表方。何氏定喘汤在原方的基础上去白果,加百部,炙紫菀,白前,橘红,象贝母,炙地龙化裁而成,全方具有宣肺平喘、清热化痰、解痉止咳作用,寒温同用、宣降并进[5]。呼吸系统含有丰富的ET,同时也存在着ET受体,并且已证实内皮素是已知最强的气管和支气管平滑肌收缩剂,它有3种异构体,分别是ET-1、ET-2、ET-3,其中以ET-1作用最强[6],并且ET-1还是一重要的前炎症因子[7]。有研究发现,在慢性支气管炎鼠模型上,BALF、血浆及肺组织ET-1水平显著增加,与气道炎症损伤指标呈显著正相关[8]。随着慢性支气管炎症的加重,逐渐向肺气肿、肺心病进展时,血浆中ET-1逐渐增高[9]。

图1 何氏加味定喘汤对慢性支气管炎大鼠肺与支气管组织形态的影响

本实验研究发现,慢性支气管炎大鼠血清、肺组织匀浆中ET-1较正常组显著增加,何氏加味定喘汤可剂量依赖地逆转这些改变,高剂量组均接近正常水平,与模型组比较具有非常显著的差异。提示何氏加味定喘汤可通过有效抑制ET-1的产生,控制肺部慢性炎症,延缓疾病进展。慢性支气管炎的病理改变主要表现为支气管上皮细胞变性、坏死、脱落,后期出现鳞状上皮化生,纤毛变短、黏连、倒伏、脱失。运用烟熏法造模,病理切片可见大鼠支气管纤毛柱状上皮变性、坏死脱落,再生的上皮杯状细胞增多,并发生鳞状上皮化生;炎症向管壁周围组织及肺泡扩展。何氏加味定喘汤低剂量组大鼠仍有支气管纤毛柱状上皮变性、坏死脱落现象,但中高剂量组无这些病理改变,提示随着剂量增高,何氏加味定喘汤改善支气管纤毛病理损伤,促进纤毛功能的恢复,利于气道分泌物的排出;何氏加味定喘汤中、高剂量组支气管管壁平滑肌均很完整,炎症控制明显,虽然管壁充血水肿现象还存在,但淋巴细胞、浆细胞浸润明显减轻,显示很好的治疗效果。

[1]李庆云,黄绍光,吴华成.大鼠吸烟致慢性支气管炎模型气道炎症研究[J].上海第二医科大学学报,2004,24(1):31-35.

[2]李洁,任世禾.慢性支气管炎的中医药治疗[J].吉林中医药,2012,32(8):786-788.

[3]张成新,徐静,赵晓琴.浅谈慢性支气管炎从痰饮辨治[J].新疆中医药,2002,20(2):1-2.

[4]陈拥军,庞晓钟.李鸿娟主任医师治疗慢性支气管炎经验[J].吉林中医药,2008,28(1):10-11.

[5]何焕荣.加味定喘汤[J].江苏中医药,2008,40(3):14.

[6]蒋连强.内皮素对呼吸系统疾病影响研究想在[J].华夏医学,1998,11(6):849.

[7]Sabater JR,Otero R,Abraham.W.M,et al.Endothelin-1depresses thacheal mucus velocity in ovine airways via ET-A receptors[J].AmJ Respir Crit Care Med,1996,154:341-345.

[8]方秋红,赵鸣武.慢性支气管炎大鼠内皮素和肾上腺髓质素水平的变化及牛磺酸的作用[J].北京医科大学学报,2000,32(8):13.

[9]江和平,姜文明.慢性肺疾病患者血浆内皮素-1、一氧化氮、血液流变学变化的关系[J].山东医药,2009,49(3):67.