微孔板结合化学发光法快速测定覆盆子中总糖蛋白的抗氧化活性

雷利芳，游 静，曾华金，杨 冉*，屈凌波，3*

(1.郑州大学化学与分子工程学院，河南郑州 450001;2.郑州大学药学院，河南郑州 450001;3.河南工业大学化学化工学院，河南郑州 450001)

1 引 言

糖蛋白(glycoprotein)是生物细胞的重要组成部分，是一类由比较短且通常具有分支的寡糖与多肽链某些特殊部位的羟基或酰氨基共价连接而成的结合蛋白质。随着国内外科学工作者对糖蛋白性质、结构、功能认识的不断深入，发现植物糖蛋白除了具有凝集素、结构蛋白、酶、贮藏蛋白和毒素等方面的作用外，还具有多种保健功能，如抗糖尿病［1］、降血脂［2］、抗氧化［3-4］、免疫调节［5］、抗肿瘤［6］等。因此，植物糖蛋白在新型特种药物及功能性保健品开发方面具有广阔的应用前景，是继多糖之后天然活性成分研究的又一热点。

覆盆子是蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子(Rubus chingii Hu.)的近成熟干燥果实，始载于《名医别录》，具有“益肾、固精、缩尿”之功效。通过家蝇寿命实验，对100个抗衰延寿古方进行筛选研究表明，覆盆子为作用最为显著的7味中药之一，因而覆盆子具有较强的延缓衰老的作用［7］。现代药理学研究表明，覆盆子中所含的糖蛋白具有明显清除O2－、·OH和H2O2等自由基的成分，可能是覆盆子延缓衰老的物质基础之一［8］。然而，这些测定清除自由基的方法往往采用传统的比色法，方法样品用量大，操作繁杂费时，不利于样品的快速检测及高通量筛选。因此，建立一种微量、简单可靠的测定覆盆子糖蛋白抗氧化的方法，对于研究覆盆子延缓衰老的物质基础及其作用机理具有非常重要的意义。

本文将微孔板与化学发光法结合，利用鲁米诺-过氢化氢(luminol-H2O2)、鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠(luminol-pyrogallol-NaOH)和鲁米诺-硫酸铜-过氧化氢(luminol-CuSO4-H2O2)化学发光体系，对不同地方市售覆盆子中的总糖蛋白进行抗氧化活性研究，为覆盆子抗衰老机理提供了实验基础。

2 实 验

2.1 主要仪器与试剂

实验中使用的仪器主要有Centro XS3 LB 960化学发光分析仪(Berthold technologies，Germany)，可拆卸96孔聚苯乙烯板(Corning，UAS)，PHS-3C精密pH计(上海精科雷磁仪器厂)，AL-104电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)等。覆盆子购于全国各药材店(1-浙江Ⅰ，2-浙江Ⅱ，3-广西Ⅰ，4-广西Ⅱ，5-福建Ⅰ，6-福建Ⅱ，7-江苏，8-广东，9-吉林，10-辽宁，11-河南，12-四川)。

鲁米诺储备液(10 mmol·L－1)的配制:准确称取0.177 2 g 鲁米诺(Sigma，USA)，用0.1 mol·L－1的NaOH溶液溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，避光保存，放置3 d后使用，使用时用水稀释至所需浓度。

邻苯三酚储备液(0.01 mol·L－1):准确称取0.012 6 g邻苯三酚，超纯水定容至10 mL，使用时用水稀释至所需浓度。其它所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

2.2 覆盆子总糖蛋白的提取［9］

称取覆盆子粉末7.0 g，加入100 mL蒸馏水，常温下于超声波提取50 min，然后在4 000 r/min的转速下离心10 min，取上清液，沉淀物再提取1次。合并两次的上清液，按5∶1的体积比加入Sevag试剂 V(氯仿)∶V(正丁醇)=5∶1)，剧烈振荡20 min后，在4 000 r/min的转速下离心10 min，去除游离的杂蛋白，重复3次;然后加入4倍体积的无水乙醇，于4℃下过夜，次日在4 000 r/min的转速下离心20 min取沉淀;将沉淀用少量水溶解后装入透析袋中，于4℃下用蒸馏水透析3 d，然后冷冻干燥备用。

2.3 实验方法

化学发光分析流程图如图1所示。将100 μL样品溶液加入微孔板中，然后由通道a通入氧化剂(过氧化氢溶液、邻苯三酚溶液等)，迅速振荡混均后再由通道b通入鲁米诺溶液，迅速振荡混均后记录反应10 s内的发光信号。将其中未加入样品的体系所产生的化学发光强度定义为本体发光值I0，而将样品加入到发光体系中所得到的化学发光强度定义为I，则降低的化学发光值ΔI=I0－I，以ΔI作为定量分析的依据。

图1 化学发光仪流程图。a:氧化剂溶液;b:鲁米诺溶液。Fig.1 Schematic diagram of the chemiluminescence system.a:oxidizing solution.b:luminol solution.

3 结果与讨论

3.1 覆盆子糖蛋白的提取

按2.2节方法进行覆盆子中总糖蛋白的提取，结果如表1所示。覆盆子中总糖蛋白的含量基本上保持一个水平，但可能由于覆盆子各产地的气候条件、采收时间、贮藏条件及贮藏时间的不同而略显差异。覆盆子总糖蛋白的平均提取量为(0.13 ±0.03)g，平均提取率为1.90% ±0.48%。

表1 覆盆子总糖蛋白提取结果Table 1 The extraction results of total glycoprotein from Rubus chingii Hu.

3.2 化学发光动力学曲线

实验用Centro XS3 LB 960化学发光分析仪系统研究了化学发光反应动力学性质。在碱性条件下，糖蛋白对鲁米诺-过氢化氢、鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠和鲁米诺-硫酸铜-过氧化氢化学发光体系具有显著的抑制作用(图2)。基于这一特点，可以利用这些化学发光体系测定糖蛋白清除H2O2、O2－和·OH的能力。由图2可见，空白体系的发光动力学曲线与样品体系的发光动力学曲线基本一致，但发光强度却发生了明显的变化，表明糖蛋白对这3个化学发光体系的发光强度有明显的抑制作用。在鲁米诺-过氢化氢和鲁米诺-硫酸铜-过氧化氢化学发光体系中，化学发光的差值(ΔI)达到最大值分别在进样后的8 s和5 s;而在鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠化学发光体系中，加样后立即达到最大值。因此，分别选择加样后8，5，0 s的 ΔI值计算样品清除 H2O2、O2－和·OH 能力。若按每一样品记录测定时间为10 s计算，那么每小时能测定的样品个数大约为360，这为大批样品的高通量筛选节约了大量的时间，也为抗氧化测定提供了简便有效的方法。

图2 化学发光动力学曲线。(a)鲁米诺-过氢化氢体系。a:40 μmol·L－1鲁米诺溶液加入0.48%过氧化氢溶液;b:a加入 4.4 μg·L－1糖蛋白溶液;c:a 加入 9.8 μg·L－1糖蛋白溶液。(b)鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠体系。a:0.1 mmol·L－1鲁米诺溶液加入0.25 mmol·L－1邻苯三酚溶液加入6.0 mmol·L－1氢氧化钠溶液;，b:a 加入 0.04 μg·L－1糖蛋白溶液;c:a 加入0.22 μg·L－1糖蛋白溶液。(c)鲁米诺-硫酸铜-过氧化氢体系。a:5.0 mmol·L－1鲁米诺溶液加入 0.07 μmol·L－1硫酸铜溶液加入 0.24%过氧化氢溶液;b:a 加入 4.4 μg·L－1糖蛋白溶液;c:a 加入14.8 μg·L－1糖蛋白溶液。Fig.2 Chemiluminscence signal.(a)luminol-H2O2system.a:40 μmol·L－1luminol+0.48%H2O2.b:a+4.4 μg·L －1 glycoprotein.c:a+9.8 μg·L －1glycoprotein.(b)luminol-pyrogallol-NaOH system.a:0.1 μmol L－1luminol+2.5 ×10 －4mol·L －1pyrogallol+6.0 ×10 －3mol·L －1NaOH.b:a+0.04 μg·L－1glycoprotein.c:a+0.22 μg·L－1glycoprotein.(c)luminol-CuSO4-H2O2system.a:5.0 μmol·L －1luminol+0.07 μmol·L －1CuSO4+0.24%H2O2.b:a+4.4 μg·L －1glycoprotein.c:a+14.8 μg·L －1glycoprotein.

3.2 实验条件的优化

为了获得最佳的检测灵敏度和最适合的声噪比，对各个发光体系中的溶液浓度进行了考察，结果如表1所示。从表中可以看出在鲁米诺-过氧化氢体系中，当鲁米诺浓度为 40 μmol·L－1，过氧化氢浓度为0.48%，且pH值为9.2时，样品清除H2O2的能力最强;在鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠体系中，当鲁米诺浓度为 0.1 mmol·L－1，邻苯三酚浓度为 0.25 mmol·L－1和 NaOH 浓度为 6.0 mmol·L－1时，样品清除 O2－的能力最强;而在鲁米诺-硫酸铜-过氧化氢体系中，当鲁米诺浓度为5.0 μmol·L－1，CuSO4浓度为 0.07 μmol·L－1和H2O2浓度为0.24%时，样品清除·OH的能力最强。

表2 测定糖蛋白的最佳条件Table 2 The optimum conditions for determination of glycoprotein

3.3 线性范围、精密度及检出限

在上述优化条件下，利用各化学发光体系对不同市售覆盆子中糖蛋白进行了测定，结果见表2。在上述3种化学发光体系中，发光强度ΔI均与一定浓度范围内的糖蛋白呈线性关系。对浓度为50 μg·L－1的糖蛋白溶液分别用鲁米诺-过氢化氢、鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠和鲁米诺-硫酸铜-过氧化氢体系平行测定6次，得到3种化学发光体系的板内及板间标准偏差分别为2.08%、1.77%、2.13%和 5.78%、3.23%、3.64%。

表3 覆盆子糖蛋白的回归方程、线性范围、检出限及IC50值Table 3 Linear regression equations，linear ranges，detection limit and IC50of glycoprotein of Rubus chingii Hu.

续表3

3.4 糖蛋白清除自由基能力相关性分析

将上述所获得的IC50值，采用 Spearman等级相关系数法(SPSS 19.0统计软件，USA)对覆盆子中糖蛋白清除H2O2、O2－和·OH能力进行相关性分析(表3)。结果表明，在置信度为0.95时，覆盆子总糖蛋白清除H2O2和·OH的能力显著相关(r=0.643，p=0.024)，而清除H2O2和·OH的能力与清除O2－的能力却没有明显的相关性(r= － 0.042，p=0.897;r=0.273，p=0.391)，这一结果与其反应动力学曲线相对应。在清除H2O2和·OH自由基时，化学发光类型表现为辉光型，而在清除O2－自由基时却表现为闪光型。然而，由于糖蛋白结构比较复杂，即使通过纯化分离得到分子量相对单一的糖蛋白，也会由于蛋白质所连接糖的差异而有所不同，因而对糖蛋白抑制化学发光的机理研究还需进一步探索。

表4 覆盆子糖蛋白清除自由基相关性结果Table 4 The correlation results of scavenging free radical of glycoprotein of Rubus chingii Hu.

4 结 论

将微孔板与化学发光法相结合，建立了一种快速测定覆盆子中总糖蛋白清除自由基活性的方法。与传统的比色法相比，该方法具有样品用量少、操作简单、检则速度快等优点，适用于中药中有效成分的抗氧化活性检测及药物活性的大批量筛选。

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