LED用于伤口愈合的研究

包熙鸿 刘木清 周小丽 王利新

(1.复旦大学光源与照明工程系，上海 200433;2.复旦大学中山医院，上海 200433)

1 引言

伤口愈合困难是临床各科常见的并发症。多种因素可导致伤口愈合困难，包括:烧伤;糖尿病引起的微循环障碍;下肢动脉粥样硬化导致的血管病变;静脉瓣膜功能不全所致静脉高压;放射性损伤;化学性药物损伤等。目前临床上最常见的四种溃疡是压力性溃疡褥疮、静脉性溃疡、糖尿病性溃疡和缺血性溃疡［1］。近年来，随着长期卧床、CVI、糖尿病和动脉粥样硬化等上述伤口溃疡易发病因的发病率日益上升，由此引起的伤口愈合困难的发生率也随之逐年升高，导致患者住院天数、离开工作时间、住院费用和社会总医疗支出不断增加。因此临床上亟需一种有效、简单、使用方便的促进伤口愈合的治疗方法。光照疗法的原理是特定波长的单色光具有影响细胞生物学行为的能力同时没有明显的损伤作用［2］传统的创伤治疗采用激光作为照射光源，然而激光发生装置由于体积大，价格昂贵，仅能发射出一小光点，无法照射大面积伤口，在临床上的应用受到限制。近年来由于LED发光强度的增加，渐渐有研究欲以LED取代激光。LED光源体积小，价格便宜，可排列成阵列应用于大面积伤口照射，同时波长单一，成为低能量光照应用在伤口愈合的优势［3］。

2 LED对细胞活率及羟脯氨酸合成的影响

既往的研究显示:630－830nm近红外线可促进伤口愈合。使用近红外线诱导机体72－kDa热休克蛋白的产生 (HSP70)。HSP是温血动物 (含人类)遇到体温升高超过5℃的情况下，体内所产生的一种蛋白质，允许身体细胞、组织与器官对抗体温升高。近期的研究发现此蛋白质能提高身体对抗低氧症 (hypoxia)、 贫 血 (ischemia)、 发 炎(inflammation)的能力;促进机体对抗重金属污染与细菌毒素 (endotoxin)污染的能力［4］。单色的光照疗法能促进多种细胞的分裂与增殖能力，包括成纤维细胞、角质形成细胞、人类成骨细胞、淋巴细胞、间质干细胞、主动脉平滑肌细胞、动脉和静脉内皮细胞。光照疗法还可促进成纤维细胞合成和分泌胶原纤维I和胶原纤维III，胶原纤维是伤口疤痕形成的骨架，有助于疤痕形成［5］。同时，在溃疡局部照射这种近红外光线可改善局部的血液循环，提高局部组织的含氧浓度，促进炎症、水肿的吸收消散，减轻疼痛，同时还能提高机体的免疫力及代谢水平，改善机体的营养状况;能刺激巨噬细胞的吞噬作用和肉芽组织的新生从而加快创伤皮肤的愈合。RodrigoSM等的研究显示，光照疗法不仅能促进直接照射处的伤口愈合，还能提高同一动物照射之处以外的伤口愈合速度。表明光照疗法具有全身系统的提高机体愈合的能力［6］。本文采用830nm红外LED以及630nm红光LED作为照射光源，研究光照射后对细胞活率以及羟脯氨酸合成的影响，从而得出LED用于创伤治疗的可行性。

2.1 细胞培养

人皮肤成纤维细胞由中上海医学院实验动物中心提供。将细胞制成悬液，取一滴细胞液经4%的台盼蓝染色后，于光镜下进行细胞成活率观察，如细胞成活率大于97%，则接种于96孔板 (5×103个细胞/孔)中，并加入含10%胎牛血清的无酚红DMEM细胞培养液，随后再置人CO2培养箱内培养24h(5%CO237℃环境下)待用。

2.2 LED光照射对细胞活率的影响

分别将成纤维细胞以1×106个/ml、1×106个/ml、100ul/孔接种到96板孔中，每孔中加10ul石蜡油防止增发。对比孔只加培养基不加细胞，以每4孔为正方形单位接收辐射，每种细胞1块96孔板。辐射时将培养板置于自制37℃简易恒温箱中保持温度，以波长830nm的LED光束从下方正方形开孔中射入，正好照射4孔的底面，每孔底面积为0.785cm。设置4个照射组，分别照射2、5、10、15、20和60min。照射后，立即将细胞置于37℃、5%CO2、100%湿度培养，48h后加入20ulMTT/PBS(10mg/ml)，继续培养4h，然后每孔加入100ul二甲基亚砜，快速振荡60min后在酶联检测仪上测定490nm处OD值，重复3次。

2.3 LED对细胞羟脯氨酸合成的影响

取第3—6代细胞制成细胞悬液，接种于24孔板中，每孔1ml(细胞浓度约为2×105个/ml)，将其置于CO2，培养箱 (5%CO2、37℃环境下)内培养24h后，轻轻吸去每孔中含10%胎牛血清的DMEM培养液，并改用无血清、无酚红的DMEM培养液继续培养，每孔添加1ml培养液。涉及研究胶原合成的LED照射组根据照射强度的不同，共分为4小组，LED照射时间均为300s，照射功率分别为①200mW;②150mW;③100mW;④50mW，待处理样品于激光照射48h后，轻轻吸去细胞培养上清液，按羟脯氨酸检测试剂说明书制备稀释倍数为1的检测液，另取Hyp标准品作为反应标准对照管，按照羟脯氨酸检测试剂说明书加入相应的试剂，混匀后于60℃水浴中作用15min，随后流水冷却，再以3500r/min的速度离心10rain，取上清液，于分光光度仪下测定550nm处的吸光度 (A)值，计算标准曲线同归方程.并以此计算样品含量。以上各项实验操作均重复6次，取其平均值纳入研究数据。

羟脯氨酸 (ug/ml)含量=测定管吸光度—空白管吸光度/标准管吸光度—空白管吸光度

上述各项实验均设有对照组，在实验过程中均不给予LED照射，细胞培养方法与各LED照射组一致。

3 实验结果

3.1 红光LED实验结果

采用功率为1W，主波长为630nm，半波宽为5nm的红光LED为照射光源，对细胞进行照射。其中LED采用恒流驱动，分别取四组电流值测出其相对应的照射到细胞表面的功率值200mW，150mW，100mW，50mW。实验结果整合成图表如图1图2所示。

图1 红光功率对羟脯氨酸合成的影响Fig.1 Effect of red light power on hydroxyproline synthesis

图2 红光功率对细胞活率的影响Fig.2 Effect of red light power on live cell rate

从图1可以看出，当红光功率大于100mW时，羟脯氨酸合成明显增加，提示胶原蛋白合成增加;在此前提下，只考虑功率150mW、200mW功率时，可以看出照射时间在10－15min效果较好;因此结合图2，只考虑功率功率150mW、200mW，照射时间在10－15min的情况，可以看出在 LED功率200mW时，照射的最佳时间为时间15min，当LED功率为150mW时，照射时间为10min;因此在采用红光LED作为照射光源时宜采用照射功率为150mW或者200mW照射相应的时间为佳。

3.2 红外LED实验结果

采用功率为1W，主波长为830nm，半波宽为5nm的红外LED为照射光源，对细胞进行照射。其中LED采用恒流驱动，分别取四组电流值测出其相对应的照射到细胞表面的功率值200mW，150mW，100mW，50mW。实验结果整合成图3和图4。

图3 红外功率对细胞活率的影响Fig.3 Effect of Infrared power on live cell rate

图4 红外功率对羟脯氨酸合成的影响Fig.4 Effect of infrared power on hydroxyproline synthesis

由图3可见红外功率50mW、100mW照射细胞活率明显高于其他两组，照射时间5－20min均可结束;故图4中，羟脯氨酸合成，只考虑红外功率50mW、100mW两组，照射时间在5－20min，可以看出红外功率50mW，照射时间15－20min效果最好;因此在采用红外LED作为照射光源时宜采用照射功率为50mW或者100mW照射相应的时间为佳。

4 实验结果分析

结合我们细胞实验分析，筛选出的150－200mW红光光源照射在约2cm直径光斑范围内，照射10－15分钟;50mW－100mW红外光源照射在约2cm直径光斑范围内，照射15－20分钟这两种方案，对于细胞活率以及羟脯氨酸合成会有显著效果，从而推断其在伤口愈合领域能起到促进愈合的作用。分别计算其能量密度，红光为47.78mw/cm2(28.668J/cm2)，63.69mw/cm2(38.214J/cm2)，红外为 15.92mw/cm2(9.552J/cm2)，31.85mw/cm2(19.11J/cm2)。也就是相应的照射功率红外要较红光低一些。根据Glynis Ablon在《Combination 830－nm and 633－nm Light－Emitting Diode Phototherapy Shows Promise in the TreatmentofRecalcitrant Psoriasis:Preliminary Findings》中的实验方法，其选择的红光能量密度较大 (126J/cm2)，红外光能量密度较小 (60J/cm2)［7］，这与我们的实验结果趋势基本相符。

5 结论

本文通过细胞实验得出了红光和红外LED对细胞增殖及羟脯氨酸合成的影响，从而得出了红光和红外LED照射时的最佳的功率和照射时间，为后续研究LED创伤治疗仪提供了理论依据，为了检验其正确性后续会进行相关动物实验的研究从而进一步探究LED在伤口愈合领域所起到的作用。

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［6］Rodrigo SM.Analysis of the systemic effect of red and infrared laser therapy on wound repair.Photomed Laser Surg.2009，27(6):929－35.

［7］Glynis Ablon.Combination 830－nm and 633－nm Light－Emitting Diode Phototherapy Shows Promise in the Treatment of Recalcitrant Psoriasis: Preliminary Findings.Photomedicine and Laser Surgery，2010，28(1):141－146.