链脲佐菌素诱导的大鼠海马神经元超微结构变化

姜远红，高 充(山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室，太原 03000;山西医科大学基础医学院老年医学研究所; 通讯作者，E－mail:gcprimg@gmial.com)

由于二型糖尿病(T2DM)与老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)存在的相似病理特征［1］，使得利用糖尿病模型诱导认知功能障碍成为可能。二者间的相关性包括:同为老化退行性病变，高胆固醇危险因素，相似的代谢功能紊乱，相似的β淀粉样蛋白(amyloid，protein，Aβ)堆积，以及细胞内信号途径的失调如糖原合成酶激酶3(GSK3)的过度活化等［2，3］。腹腔注射链脲佐菌素(streptozcin，STZ)可以诱导大鼠出现胰岛素抵抗(insulin resistance)症状，这被认为是诱导糖尿病实验动物模型的经典方法［4］。而STZ的侧脑室注射大鼠，则已经被广泛证明可以成功诱导出大鼠AD样病理变化，这一系列变化包括:行为学改变、电生理改变(长时程增强的压抑)、细胞外β淀粉样蛋白的聚集(Aβ)，以及细胞内tau蛋白的过度磷酸化等［5－8］。相同药物的外周给予和中枢给予能诱导两类不同的疾病，这也从另一个侧面证实了T2DM与AD的密切联系。本实验基于STZ的神经毒性作用，利用投射电子显微镜(TEM)观察STZ侧脑室注射后大鼠海马神经元与对照组的差异，旨在研究中枢注射STZ对大鼠海马的超微结构变化的影响，从而探索在由于胰岛素功能异常所引发的AD情况下，海马神经元的超微病理学变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3月龄雄性SD大鼠(240－270 g)(山西医科大学实验动物中心)12只被平均随机分为对照组和STZ组(n=6每组)。实验动物的饲养采取自由取食取水，恒温恒湿状态，温度为室温。采取12 h黑暗光照循环。

1.2 实验试剂

对照组侧脑室注射所用人工脑脊液(aCSF:NaCl 140 mmol/L;KCl 3.0 mmol/L;CaCl22.5 mmol/L;MgCl21.2 mmol/L;NaH2PO41.2 mmol/L，pH 7.4)，实验组大鼠侧脑室注射 STZ(Sigma公司，3 mg/kg，溶于 aCSF中)。大鼠腹腔注射麻醉用药10%水合氯醛。组织固定所需试剂:2.5%的戊二醛，二甲砷酸钠缓冲液(0.1 mol/L;pH 7.4)。

1.3 实验器材

大鼠侧脑室注射所需器材:注射器，手术刀，手术剪，微量注射器(5 μl)，非吸收缝合针线，大鼠立体定位仪(深圳瑞沃德公司)，颅骨钻。

电镜观察:LKB超薄切片机，JEOL 1101电子显微镜。

1.4 实验方法

侧脑室注射:10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于大鼠立体定位仪，颅骨钻开颅，定位前囟点后0.8 mm，旁开1.5 mm，深度3.6 mm，单侧侧脑室注射10 μl(aCSF或STZ溶液)，术后恢复2周。

投射电镜观察:大鼠海马电镜切片的制作遵循本研究室之前的方法［6］。大鼠以10%水合氯醛腹腔过量麻醉，断头后取脑并剥离海马。海马切片在2.5%的戊二醛内固定2.5 h(4 ℃)，0.1 mol/L 二甲砷酸钠缓冲液中(pH 7.4)洗涤两次，每次10 min，1%四氧化二锇后固定2 h，丙酮系列脱水(30%，50%，70%，80%，90%，95%停留 5－10 m;100%丙酮三次，每次5－10 m)，环氧树脂618包埋，LKB超薄切片机切片(厚度500 Å)，醋酸铀－柠檬酸铅双染色，JEOL－1101电子显微镜观察(日本电子)。

2 结果

2.1 STZ诱导大鼠海马神经元细胞超微结构改变

对照组大鼠海马神经元表现出了完整的细胞结构(图1A，B)。而STZ处理后，大鼠海马神经元出现了各种细胞结构变化。STZ组大鼠海马神经元出现了核周隙增宽，部分核膜消失(图1C，D箭头)，以及细胞器变化，如线粒体部分溶解(图1D，箭头);STZ还诱导出了大鼠海马神经元内质网结构的变化，如内质网间隙的增宽(图1E，箭头)，另外STZ组大鼠某些大鼠海马神经元出现了核仁的分离(图1F，箭头)。STZ的处理组除出现了一些异常早期细胞超结构变化外，还显示出了一些严重的超微结构损伤，如核周隙的严重扩大，内质网结构的严重损伤(图1G，箭头)，以及除核结构以外其他胞质结构如线粒体完全被降解(1H)。

图1 STZ诱导的大鼠海马神经元超微结构变化 (Bar=1 μm)Fig 1 Ultrastructure of hippocampal neurons in STZ-induced rats (Bar=1 μm)

2.2 STZ诱导的大鼠海马神经元突触超微结构的变化以及核蛋白体变化

STZ还诱导了海马神经元突触超微结构的变化，其中最主要的变化就是突触囊泡的异常聚集。在对照组中大鼠海马神经元突触结构正常，并且囊泡数量正常(图2A)，而STZ组大鼠海马神经元突触末端则出现了大量聚集的囊泡(图2B)。此外，STZ组大鼠海马神经元还出现了核蛋白体的异常聚集(图2C，D)，而这种异常聚集也合并了内质网间隙的增宽(图2C)。

图2 STZ诱导的大鼠海马神经元突触结构的变化Fig 2 Changes of synaptic structure of hippocampal neurons in STZ-induced rats

3 讨论

海马是AD病变过程中主要受损的区域，并且早已有研究证实STZ的侧脑室注射能够引起海马内突触结构的退行性变及其动物学习记忆能力的下降［9］。本研究中，我们利用了TEM手段直接观察STZ诱导的大鼠海马神经元的超微病理学变化，并且我们发现了STZ单次侧脑室注射诱导出了大鼠海马神经元的早期AD样超微结构变化，如细胞核结构改变，包括核周隙增宽，部分核膜消失甚至出现了核仁分离现象。这一系列细胞超微结构的某些异常提示了海马神经元正在经历早期细胞凋亡过程以及氧化应激反应［10］，甚至出现了细胞亚结构的溶解现象。而在突触结构中出现的大量囊泡，提示了异常的突触兴奋性，这一现象提示早期的氧化应激反应，并且这种异常兴奋性可能与早期AD病人的部分癫痫样或狂躁型病例相关［11，12］。而这一系列的超微结构变化为STZ诱导的大鼠其他方面的AD样病理变化如行为学和电生理变化提供了一定的超微结构支持。

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