αA晶体蛋白基因启动子与HSP70融合基因表达载体的构建及鉴定＊

姜婧怡，葛正龙

(遵义医学院生物化学与分子生物学教研室，贵州遵义 563099)

晶状体内没有血管和神经，所需的营养均来自房水，因此易于遭受各种应激因子的损害，影响晶状体的正常代谢，使晶状体内蛋白质发生变性，不溶性蛋白质相应增多，透明的晶状体就出现混浊成为乳白色，发生白内障［1］。

近来的研究表明，热休克蛋白(heat shock protein，HSP)可帮助晶状体中新合成的蛋白质分子获得天然构象，保护它们免受应激损害，阻止蛋白质的不正确折叠或变性，或帮助变性的蛋白质复性［2］。HSP70是一种重要的热休克蛋白，Bagchi等通过研究证实在人眼中，HSP70等见于晶状体上皮细胞和前皮质纤维，在晶状体上皮细胞中，HSP70的表达量随年龄增大而下降，这种下降可能与老年性白内障的发病有关［3］。如果使HSP70在晶状体上皮细胞中定向表达，发挥其分子伴侣活性，恢复变性蛋白活性，可达到抑制白内障的目的。使外源基因定向在靶组织表达，理想的方法就是将该组织特异表达的启动子与外源基因片段构建为融合基因。

晶状体蛋白是人类晶状体细胞胞浆中重要的结构蛋白，在晶状体水溶性蛋白中约占90%，有研究表明αA－晶体蛋白仅局限在晶状体内表达，其它组织仅有少量被发现［4］，因此，可以说 αA－晶体蛋白是晶体特异性蛋白，将αA－晶体蛋白基因启动子与HSP70基因片段构建为融合基因，可定向在晶状体内表达。

1 材料

1.1 质粒和菌株 本实验室构建的 pαACPIRES2－EGFP、pIRES2－EGFP－HSP70重组表达质粒。菌株E.coil DH5α本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器 质粒小量抽提试剂盒(Zomanbio)，胶回收试剂盒(Zomanbio)，DNA MARKERⅥ(Zomanbio)，AseⅠ(Fermentas)，XhoⅠ(Fermentas)，BamHⅠ(Fermentas)，T4 DNA Ligase(Zomanbio)，2 × Taq PCR MasterMix(ZOMANBIO)。PTC0200梯度 PCR仪(Bio－Rad，美国)，SYNGENE型凝胶电泳图像分析(GeneGenius，美国)，IPR150.XX1.5普通培养箱(Sanyo，日本)，481型恒温制冷摇床(Forma，美国)。

2 方法

2.1 目的基因的获得

2.1.1 根据GeneBank提供的HSP70基因序列(NM－005345)，设计一对引物，P1:5＇－ CCCTCGAGAGCAGGGAACCGGCATG － 3＇，划 线部分为XhoⅠ酶 切 位 点;P2:5＇－ CGGGATCCCAAACACAGGAAATTGAGAACTGAC － 3＇，划线 部 分 为BamHⅠ酶切位点。PCR扩增目的基因，反应体系为:引物 P1、P2 各 1 μL，pIRES2－EGFP －HSP70 1 μL，2×Taq MIX 12.5μL，ddH2O 9.5μL。轻弹试管混匀，离心3～5 s后置于PCR仪中，按以下程序进行循环:94℃预变性10 min，94℃变性1 min，57℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环后72℃保温10 min，4℃保存备用。pIRES2－EGFP－HSP70质粒图谱(见图1)。

2.1.2 扩增产物的分离及回收 用琼脂糖凝胶电泳分离HSP70基因的扩增产物(1.0%琼脂糖，120 V，30 min)，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收1 900 bp左右的目的片段，－20℃保存。

图1 pIRES2－EGFP－HSP70质粒图谱

2.2 目的基因的重组

2.2.1 质粒pαACP－IRES2－EGFP扩增 将含pαACP－IRES2－EGFP质粒的大肠杆菌 DH5α菌种接种于LB/kana琼脂板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。挑取单菌落接种于LB/kana细菌培养液中过夜振荡培养。用质粒小量提取试剂盒提取pαACP－IRES2－EGFP质粒，－20℃保存。

2.2.2 质粒pαACP－IRES2－EGFP的限制酶切及载体片段的分离、回收 XhoⅠ、BamHⅠ限制酶切。反应体系为:ddH2O 8μL，质粒DNA 6μL，10×Buffer 4μL，XhoⅠ、BamHⅠ各1μL。37℃水浴4 h。取5μL酶切产物电泳(1.0%琼脂糖，120 V，30 min)并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段(含EGFP的片段)。pαACP－IRES2－EGFP质粒图谱(见图2)。

图2 pαACP－IRES2－EGFP质粒图谱

2.2.3 PCR产物连接至 pαACP－IRES2－EGFP载体 (构建pαACP－HSP70)相关试剂于冰水混合物中融化，依次加入以下试剂:T4 DNA Ligase 1 μL，10 × Buffer 1 μL，HSP70 1 μL，pαACP － IRES2－EGFP 3μL，ddH2O 4μL。轻弹管底后离心3～5 s，置于PCR仪中16℃过夜(约16 h)。质粒构建视图(见图3)。

图3 重组质粒pαACP－HSP70构建视图

2.2.4 转化反应及质粒提取10μL连接液取转化感受态大肠杆菌DH5α，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落接种于LB/Kana细菌培养液中过夜振荡培养。用质粒小量抽提试剂盒提取质粒。

2.3 重组质粒的检测

2.3.1 PCR检测重组质粒中HSP70基因片段从重组质粒转化菌液中用扩增HSP70的引物PCR扩增HSP70基因(反应体系及循环条件同2.1.1)。

2.3.2 酶切检测重组质粒中HSP70基因片段及αACP基因片段重组质粒DNA的酶切检测。分别用XhoⅠ、BamH和AseⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。

2.3.3 DNA序列分析将经PCR及酶切检测后正确的重组质粒相应菌液送上海生工生物工程技术服务公司(测序部)测序。

3 结果

3.1 目的基因的获取 对质粒pIRES2－EGFPHSP70的PCR扩增产物行1%的琼脂糖凝胶电泳，可见约1 900 bp(1924 bp)的DNA片段，与预期大小相符(见图4)。

3.2 目的基因的检测

3.2.1 PCR检测重组质粒中HSP70基因片段对质粒pαACP－HSP70的PCR扩增产物行1%的琼脂糖凝胶电泳，可见约1 900 bp(1 924 bp)的DNA片段，与预期大小相符(见图5)。

3.2.2 酶切检测

3.2.2.1 酶切鉴定重组质粒中HSP70基因片段将质粒pαACP－HSP70双酶切(XhoⅠ、BamH Ⅰ)产物行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可见约5 200 bp和1 900 bp的DNA片段，其中5 200 bp片段为质粒pαACP－IRES2－EGFP的 DNA 片段，1 900 bp片段为HSP70的DNA片段，均与预期大小相符(见图6)。

3.2.2.2 酶切鉴定αACP基因启动子片段 将质粒 pαACP－HSP70双酶切(AseⅠ、XhoⅠ)产物行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可见约6 600 bp和450 bp的DNA片段，其中6 600 bp片段为质粒pαACP－IRES2－EGFP的 DNA片段，450 bp片段为 αA晶体蛋白基因启动子的DNA片段，均与预期大小相符(见图7)。

3.3 DNA序列分析 测序结果表明本实验所克隆HSP70基因与基因库中的同种序列比较均有100%的同源性，证实真核表达载体 pαACPHSP70构建成功。测序结果比对图和测序结果峰值图(见图8、图9)。

图9 重组质粒pαACP－HSP70中HSP70基因的DNA测序结果峰值

4 讨论

白内障(catarat)是主要的致盲疾病之一，根据1999年流行病学调查已证明白内障是我国第一位的致盲眼病［5］。目前为止，外科手术是白内障最主要的治疗方式［6］，但手术治疗本身存在着一定的风险和危险的并发症，因此，探寻一种安全而有效的治疗白内障的方法具有现实意义。随着分子生物学技术的发展，人们对疾病分子机制认识的深入，基因治疗的疾病谱范围的扩大［7］，通过导入外源基因来治疗和抑制白内障正逐渐被人们所研究。

HSP70是重要的伴侣蛋白，能与蛋白分子结合，参与蛋白质的伸展、折叠及多聚复合体的组装，当蛋白质受损而变性时，促使受损蛋白质恢复，并加速其降解和清除，维护细胞的功能［8］。目前，已有通过诱导细胞产生内源性HSP70或利用外源性HSP70治疗肝炎、肿瘤、耳疾病等疾病的研究报道［9－12］。随着研究的不断发展，发现白内障与HSP70有着密切的联系。已有研究证明，可溶性成分中的HSP70在正常晶状体囊膜中是明显可见的，但是随着年龄增长，HSP70 表达量减少［13－14］。HSP70在晶体上皮细胞中的的表达量减少可导致晶状体上皮细胞中变性蛋白的恢复和降解速度减慢，使晶状体的透明性受损，反映了晶状体细胞的自我修复功能的下降。研究表明，小分子热休克蛋白α－晶状体蛋白及HSP70在热应激晚期明显增加［15］。以上研究均表明HSP70与白内障关系密切，将HSP70基因定向表达于晶状体内，可能会起到抑制白内障的作用。

晶状体蛋白是人类晶状体细胞胞浆中主要的结构蛋白，在晶状体水溶性蛋白中约占90%，已有研究表明αA晶体蛋白仅局限于晶状体内表达，其它组织仅有少量被发现［4］，因此，可以说 αA－晶体蛋白是晶体特异性蛋白，将αA－晶体蛋白基因启动子与HSP70基因片段构建为融合基因，可定向在晶状体内表达。

本课题组在前期实验中通过基因克隆的方法克隆小鼠αA晶状体蛋白基因特异性启动子活性片段(αACP)，利用基因重组技术将αACP替换真核表达载体pIRES2－EGFP上的CMV启动子，命名融合质粒为 pαACP－IRES2－EGFP，通过 DNA测序证实其克隆成功，并实现其在大鼠晶状体上皮细胞中的特异性表达。本实验首先运用PCR的方法扩增HSP70基因，通过基因重组技术与pαACP－IRES2－EGFP连接，构建晶状体特异性表达载体pαACP－HSP70，酶切、PCR 检测 HSP70及启动子αACP基因片段，结果与预期相符;将重组质粒送往上海生物技术有限公司测序，结果显示所克隆的HSP70基因与基因库中的同种序列比较，核苷酸序列有100%的同源性。实验结果表明:晶状体内特异性表达载体pαACP－HSP70构建成功，相较于其他基因表达载体，pαACP－HSP70有如下优点:①含有αA－晶体蛋白基因启动子的活性片段即αACP，因其在晶状体内特异性表达，可使连接的外源基因HSP70在晶状体内定向表达，使基因治疗白内障更具靶向性。②含有EGFP，在外源基因HSP70下游含有报告基因EGFP，检测外源基因的表达可以通过检测EGFP表达的绿色荧光蛋白来完成，简单直观。综上所述，成功构建的晶状体内特异性表达载体pαACP－HSP70为进一步研究HSP70基因对白内障的治疗作用奠定基础。

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