黑木耳粗提物在大鼠急性肾功能衰竭过程中的作用*

马小娟， 马 琪， 于文燕△， 孙 湛， 刘熠雯， 王燕杰， 郭 文， 王 珍

(新疆医科大学1病理生理学教研室，2机能中心，3临床医学系，新疆 乌鲁木齐830011)

急性肾功能衰竭(acute renal failure，ARF)是一种常见的临床危重症，尽管医疗水平有了较大的提高，死亡率仍然居高不下。目前认为，肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)的急剧降低是 ARF发病的关键环节。目前临床多采用对症治疗。尿毒清是一纯中药制剂，主要由大黄、黄芪、丹参、川芍、党参、车前草、甘草等物质组成，具有降低血肌酐、尿素氮及减少尿蛋白等功效，因此可在一定程度上稳定肾脏功能，延缓透析时间。但部分病人服用后易产生严重的腹泻，从而使机体发生水电解质代谢紊乱，加重病情。既往的研究发现，黑木耳可通过抗氧化作用减轻大鼠慢性脑缺血损伤［1］，本课题组的研究也表明，在感染性休克和脓毒血症时，黑木耳可通过降低血清中内毒素、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)及白细胞介素 1(interleukin 1，IL-1)的含量，而对重要脏器发挥保护作用［2］。黑木耳在ARF的发病过程中是否也具有保护作用，目前尚无相关报道。本实验通过观察黑木耳粗提物在大鼠腹腔注射顺铂诱发急性肾功能衰竭中的作用，探讨其可能的机制。

材料和方法

1 材料

1．1 动物 选取清洁级健康Wistar雄性大鼠32只(由新疆医科大学动物实验中心提供)，体重200～250 g。

1．2 主要试剂及仪器 尿毒清颗粒(内蒙古康臣药业有限责任公司)，顺铂(江苏豪森药业股份有限公司)，东北黑木耳(产地山东烟台)，Cobasb121血气和电解质分析仪、尿素氮和肌酐测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，逆转录试剂盒(Invitrogen)，实验用引物由生工上海生物工程股份有限公司设计并合成。

2 动物及分组

32只Wistar大鼠随机分为:(1)对照组:1次腹腔注射(ip)与顺铂等容积生理盐水(NS);(2)模型组:1次ip顺铂6 mg/kg;(3)黑木耳组:1次ip顺铂6 mg/kg+灌胃注入黑木耳粗提液(15 mL/kg);(4)尿毒清组:1次ip顺铂6 mg/kg+灌胃注入尿毒清溶液(3 g·kg－1·d－1)。每组8 只。

3 方法

各组大鼠分别腹腔注射等容积的生理盐水和顺铂，治疗组分别经胃灌注黑木耳粗提物和尿毒清。1周后从颈动脉采血测定指标，处死动物。取右肾组织快速置于液氮中，左肾组织固定于10%甲醛中，常规石蜡包埋。

4 检测指标

4．1 血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatine，Cr)的测定 从颈动脉采血2 mL后离心15 min(3 500 r/min)取上清，后按照试剂盒操作说明书测定BUN及Cr。

4．2 血气分析 各组大鼠从颈动脉采血，采用Cobasb121仪器即刻测定血气，包括血K+浓度、pH值、氧分压(partial pressure of oxygen，PO2)、二氧化碳分压(partial pressure of carbon dioxide，PCO2)、氧饱和度(oxygen saturation，SO2)、缓冲碱(buffer base，BB)和阴离子间隙(aninon gap，AG)。

4．3 RT-PCR检测各组大鼠肾组织内皮素1(endothelin-1，ET-1)mRNA的表达水平 用Trizol法提取各组大鼠肾组织总RNA，后使用。试剂盒逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳，测定各组ET-1与β-actin的灰度值并进行半定量分析。ET-1上游引物5'-atacacaaccgagcacattgac-3'，下游引物5'-tcagacacgaacactccctaag-3'，PCR产物为401 bp，退火温度为 55℃。β-actin上游引物5'-acccccactgaaaaagatga-3'，下 游 引 物 5'-atcttcaaacctccatgatg-3'，PCR产物为120 bp，退火温度为57℃。

5 统计学处理

采用SPSS17．0统计软件包对数据进行分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，实验数据经方差齐性检验后，采用方差分析和t检验，检验水准α=0.05。

结 果

1 BUN和Cr的变化

模型组、黑木耳组和尿毒清组与对照组比较，BUN和Cr含量差异均有统计学意义(P＜0.05)，黑木耳组中BUN和Cr的含量均低于模型组(P＜0.05)，见表 1。

表1 各组大鼠BUN和Cr含量的变化Table 1．Changes of BUN and Cr in every group(Mean±SD．n=8)

2 各组大鼠肾组织ET-1 mRNA表达水平

模型组与尿毒清组中ET-1 mRNA的表达高于对照组和黑木耳组(P＜0.05)，而黑木耳组与对照组比较，ET-1 mRNA的表达无显著差异(P＞0.05)，见图1。

3 血气分析

pH值:模型组、尿毒清组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而黑木耳组的pH值与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);PO2:模型组、黑木耳组和尿毒清组PO2高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);PCO2:模型组的PCO2高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，但黑木耳组与尿毒清组比较差异无统计学意义(P＞0.05);SO2:模型组、尿毒清组SO2低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，但黑木耳组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，尿毒清组SO2低于黑木耳组，差异有统计学意义(P＜0.05);BB:模型组、黑木耳组和尿毒清组均低于对照组(P＜0.05)，且黑木耳组高于模型组和尿毒清组，差异有统计学意义(P＜0.05);AG:模型组、黑木耳组和尿毒清组高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，且尿毒清组高于黑木耳组(P＞0.05);血K+浓度:模型组和尿毒清组血K+浓度高于对照组和黑木耳组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表 2。

Figure 1．The expression of ET-1 mRNA in renal tissues in different groups．Mean ± SD．n=8．▲ P ＜ 0.05 vs control group;☆P＜0.05 vs model group;△P＜0.05 vs black fungus group．图1 各组肾组织中ET-1 mRNA的表达

表2 各组大鼠血气指标的变化Table 2．Changes of the blood gas in every group(Mean±SD．n=8)

Figure 2．The pathological changes of renal tissues in different groups(HE staining，×400)．A:control group;B:model group;C:black fungus group;D:niaoduqing group．图2 各组肾组织病理学改变

4 各组大鼠肾组织病理学改变

正常组肾小球毛细血管未见扩张、充血，肾小管未见扩张，间质无出血;模型组可见肾小球毛细血管呈中、重度扩张充血，部分肾小管间质出血;黑木耳组中仅见肾小管扩张及间质血管的扩张充血;尿毒清组中肾小球毛细血管中度扩张充血，部分肾小管扩张，肾小管上皮轻度水肿，见图2。

讨 论

ARF是指各种原因在短期内(通常数小时至数天)，引起肾脏泌尿功能急剧障碍，以致机体内环境出现严重紊乱的病理过程。而内环境的紊乱又可加重原有的病情［3］。肾脏除具有泌尿功能外，还具有内分泌功能，可合成与分泌ET-1。ET通过自分泌与旁分泌的方式调节肾脏的功能，被认为是进行性肾损伤的调节因子［4］。

本研究显示，模型组肾组织ET-1 mRNA表达为0．89±0．06，且BUN和Cr的含量均明显高于对照组(P＜0.05)，可能是由于顺铂导致了肾血管的收缩，使肾血流量及GFR降低所致［5］。而肾损伤时肾内血流重分布又将影响肾血流动力学，促使内皮细胞合成并分泌更多的ET-1，即通过正反馈调节加速了肾小球的损伤。

尿毒清是临床上常用的肠道吸附剂，具有通腑降浊、健脾利湿、活血化瘀等功效，但对肾小球的作用不明显［6］。本实验通过使用尿毒清灌胃后发现，尿毒清组ET-1 mRNA的表达、BUN和Cr的含量均低于模型组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。而黑木耳隶属于真菌门，其中含大量由多糖及蛋白质等物质组成的木耳凝胶，对人体有重要的生理功能。现已发现可提高机体免疫力、抗肿瘤、降血脂和抗炎等功能。本实验黑木耳组中ET-1 mRNA的表达明显减少，BUN和Cr的含量也低于模型组。故考虑黑木耳可能通过减少血管活性物质的释放，调节局部血管的张力，从而改善肾血流量及肾小球的滤过功能，减少了代谢产物在体内的堆积。

AFR少尿期机体发生“一少四多”(少尿、水中毒、高钾血症、代谢性酸中毒和氮质血症)，其中高钾血症是最危险的改变，而其与代谢性酸中毒又互为因果［3］。因此，本实验观察了各组血气指标的改变后发现，模型组的pH值、PCO2和BB与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);尿毒清组的pH值、BB与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，但PCO2与对照组比较无显著差异(P＞0.05)，提示模型组和尿毒清组均发生了失代偿性的呼吸性碱中毒合并代谢性酸中毒。同时两组血清K+浓度均明显高于对照组(P＜0.05)。黑木耳组中pH值、PCO2与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，而BB低于对照组(P＜0.05)，提示黑木耳组发生了代偿性的呼吸性碱中毒合并代谢性酸中毒，且血清K+浓度低于模型组和尿毒清组(P＜0.05)。故考虑黑木耳粗提物可能通过维持体内电解质和酸碱平衡以达到改善内环境的目的。

综上所述，黑木耳在急性肾功能衰竭的发病过程中，具有一定的保护作用。其机制可能是影响了血管活性物质的合成与释放，调节体内电解质和酸碱的平衡，最终维持内环境的稳定。但是黑木耳对急性肾功能衰竭的肾小管有无作用，仍有待进一步研究。