徐州地区 9 株新城疫病毒的分离鉴定

李华坤

(徐州生物工程职业技术学院,江苏 徐州 221006)

新城疫是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus, NDV)引起的鸡和多种禽类的一种急性高度接触性传染病，强毒株感染易感禽常呈败血症症状，主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血[1]。因毒株的致病性不同，表现为严重程度有很大差异的疾病。多年来，世界各地均采取积极的防治措施，但该病目前依然是我国乃至世界危害禽类最严重的疾病之一，给养殖业带来了严重的经济损失。徐州地区是江苏省养禽业两大聚集地之一，为了了解该地区ND的防治效果及流行现状，2012年间，对家禽出现非正常死亡、临床症状与病理变化疑似为新城疫的病例进行病料采集、病毒的分离和鉴定，进一步对毒株的致病性进行了测定，为徐州地区的新城疫防治工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料采集

在规模化养鸡场和徐州附近的禽病门诊收集疑似新城疫病例的病料，取脑、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏等主要脏器。

1.2 仪器与试剂

高速冷冻离心机(上海安亭公司)、恒温金属水浴锅HHS-11-8型(常州诺基公司)、高压灭菌锅LDZX-50KBS(上海申安公司)、振荡器、微量移液器(德国Eppendorf公司)、96孔“V”形血凝板。SPF鸡胚购于北京实验动物中心；抗新城疫、禽流感阳性血清由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室提供；含抗生素的磷酸盐缓冲液(PBS)按文献[2]的配方配制。所用化学试剂均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 1% 红细胞制备 用注射器抽取3.8% 枸橼酸钠溶液0.5 mL。采用无菌法抽取健康的未免疫鸡的静脉血4.5 mL，混匀后置15 mL 离心管，加生理盐水适量，洗涤离心，共离心3次(第1、2次1 500 rpm, 5 min,第3次2 000 rpm, 5 min)洗去血清及白细胞。吸取红细胞0.1 mL，加入9.9 mL生理盐水，即成1%的鸡红细胞悬液。

1.3.2 病料处理 按照王伟伟[3]方法处理病料，用双抗冲洗后，研碎，加入1∶4的生理盐水，反复冻融3次后，3 000 rpm离心10 min，取上清备用。

1.3.3 病毒的分离培养 将病料上清无菌接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每份接种0.1 mL，置37 ℃培养，定期照蛋。将24～120 h内死亡的死胚,120 h内活胚置4 ℃冷却4～24 h。无菌收获尿囊液。做HA试验，如为阳性用已知抗NDV血清做HI试验，如为阴性再盲传两代。

1.3.4 血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)

1.3.4.1 血凝试验(HA) 96孔“V”型微量反应板每孔滴加25 μL PBS；加25 μL收获的尿囊液于左侧第1孔，混匀，取25 μL至第2孔混匀，连续稀释至第11孔，最后一孔留作阴性对照；各孔补加PBS 25 μL；各孔再加1%鸡红细胞25 μL，振荡混匀，室温或37 ℃温箱作用，10 min开始观察，直到结果出现。

1.3.4.2 血凝抑制试验(HI) 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制4个单位病毒溶液。 96孔“V”型微量板从第1孔至第12孔各加入25 μL PBS；第1孔加新城疫阳性血清25 μL，均匀混合后，吸25 μL至第2孔充分混合，依次倍比稀释至第10孔，弃25 μL稀释的血清，11孔和12孔分别为阳性和阴性对照；自第1孔至11孔加入25 μL 4单位病毒液，第12孔补加25 μL PBS，混合均匀，置37 ℃温箱作用10 min；各孔再加1%鸡红细胞25 μL；振荡混匀，室温或37 ℃温箱作用10 min开始观察，直到结果出现[4]。

1.3.5 1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)测定 按OIE标准提供的方法操作[5]，取HA滴度在24以上的尿囊液，用灭菌PBS 10倍稀释后，脑内接种于1日龄非免疫鸡0.05 mL，每株接种10只[3,6-8]，在负压隔离器中饲养，观察10 d，死亡计2分，发病计1分，按照下列公式计算出相应的数值。

ICPI=(8 d 内累计死亡数×2+8 d 内累计发病数×1)/8 d 内累计观察鸡总数

2 结果与分析

2.1 病毒分离与鉴定

无菌收集鸡胚的尿囊液，分装于EP管内-70 ℃保存。通过对尿囊液进行血凝及血凝抑制试验，证实所分离到的病毒具有血凝性，血凝价为26～28，未死的鸡胚无血凝价。有血凝价的病毒能被新城疫阳性血清抑制，而不能被禽流感H5(Re-4、Re-5)和H9阳性血清抑制，因此所分离的病毒为新城疫病毒(见表1)，分别命名为PZ 03-2012、TS 03-2012、TS 01-2012、SN 03-2012、SN 12-2012、SN 05-2012、SN 01-2012、LB 05-2012、SN 04-2012。

2.2 1日龄雏鸡脑内致病指数

分离毒株ICPI分别为0.21、0.28、0.35、1.89、2.48、1.81、2.85、1.98、2.11。9株NDV分离株中PZ 03-2012、TS 03-2012、TS 01-2012为弱毒株，SN 03-2012、SN 12-2012、SN 05-2012、SN 01-2012、LB05-2012、SN 04-2012为强毒株(表1)。

表1 新城疫病毒的鉴定Table 1 Identification of Newcastle disease viruses

3 讨 论

ND是由NDV引起的鸡的急性高度接触性传染病，强毒感染后常呈败血症经过。由于致病的毒株不同及免疫状态不同，所引起的临床表现存在较大的差异。本研究中，HA和HI试验表明，在徐州地区确实存在新城疫病毒的感染，分析其原因主要是目前在国内鸡群中仍然频繁使用新城疫Ⅳ系活疫苗，所以临床上分离到新城疫病毒并不能确定说该禽群爆发了新城疫，必须结合流行病学、临床症状、病理变化与分离毒株的致病性试验进行综合分析，才能准确得出判断。由于禽流感病毒感染也能引起类似的症状，在临床上容易误诊，本地区是否存在禽流感病毒，还需要进一步研究。

从我国家禽饲养模式看，国内养殖水平参差不齐，造成我国高风险禽群分布较广，对新城疫的防控形成挑战[9]。这些高风险禽群主要为养殖模式落后的农村散养户或者是个体户，养殖规模较小，甚至称不上规模，普遍存在不使用疫苗免疫或免疫程序不合理的现象。一些规模化的养殖场，由于鸡群中存在免疫抑制病[10]和免疫监测不到位，即是免疫鸡群仍有发生新城疫感染的可能。目前徐州地区的鸡场大多数未实行全进全出的饲养制度，有时鸡场内套养不同日龄的鸡，在用I系中等毒力活疫苗对青年鸡和成年鸡进行加强免疫时，会造成同群饲养的幼鸡发生新城疫感染[11]。本研究从临床发病病例中分离到新城疫强毒，是与免疫抗体水平低下有关，还是与疫苗的抗原匹配性有关，值得进一步研究。

参考文献：

[1] Alexander D J. Newcastle disease and other avian Paramyxoviridae infections[J].Disease of Poultry,edited by Calnek B W Iowa State University Press,1997.10:541-569.

[2] 萨姆布鲁克J,拉塞尔.分子克隆实验指南[M].3版.黄培堂，等，译.北京: 科学出版社, 2008.

[3] 王伟伟.江苏省新城疫病毒分子流行病学研究及鸽源分离株基因组序列的分析[D].江苏扬州:扬州大学，2009.

[4] 杨汉春.动物病毒学[M].2版.北京：中国农业大学出版社，2003:293-293.

[5] OIE.哺乳动物、禽类和蜜蜂A类和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].农业部畜牧兽医局，译.北京:中国农业科技出版社，1996:140-146.

[6] 姚春峰.我国部分地区新城疫病毒的部分生物学特性鉴定及分子流行病学研究[D].江苏扬州: 扬州大学,2007.

[7] 姚春峰,刘文博,胡顺林,等.新城疫病毒分离株的生物学特性鉴定及F蛋白基因序列分析[J]. 病毒学报, 2009,25(3):117-124.

[8] 谭伟成.新城疫病毒玉林株的分离鉴定与油乳剂灭活疫苗的研制[D].江苏南京:南京农业大学, 2007.

[9] 吴延功,丁国义,宋翠平,等.新城疫的流行特点与防控措施[J].中国家禽,2012,34(5): 5-7.

[10] 崔治中.鸡群中免疫抑制性病毒的共感染及其相互作用-对新城疫和禽流感疫苗免疫反应的抑制[J].中国动物检疫, 2007,24(10): 45-48.

[11] 孙 朋.新城疫流行现状分析及综合防控措施的建立[J].中国动物检疫，2011,28(12):79-81.