类风湿关节炎滑膜组织及关节液中DcR3表达的研究①

陈安平 袁国华 罗雄燕 杨明辉 刘素兰

(湖北民族学院风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，恩施445000)

类风湿关节炎是一种主要累及关节滑膜，以滑膜炎症反应、血管翳形成、软骨及骨破坏为特征的一种常见的关节炎性疾病。DcR3是新近发现的一种肿瘤坏死因子诱骗受体，能与多种TNF家族成员如FasL、LIGHT、TL1A等结合，从而有效地抑制了相关肿瘤坏死因子所诱导的凋亡。近年来研究发现在许多自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、矽肺、系统性硬化症等患者的外周血单核细胞及血清中也存在DcR3的高表达。RA是一种发病率和致残率均较高的一种风湿免疫性疾病，凋亡机制在RA的发病机制中占有重要地位。我们既往的研究发现DcR3在类风湿关节炎患者血清及外周血单核细胞中的表达明显增高，而其血清表达水平在风湿活动较高的患者则更加明显［1］。为了进一步探讨DcR3在RA患者滑膜组织中的表达情况，本文通过对RA患者滑膜组织用免疫组织化学方法行DcR3表达的研究，并同时用ELISA的方法研究了RA患者关节液中DcR3的表达情况，报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 滑膜组织标本来自川北医学院附属医院风湿科2009年9月至2010年5月手术患者的切除标本，其中RA患者12例，均符合1987年美国风湿病学会(ACR)分类标准，男性2例，女性10例，年龄26～69岁，平均(45±14)岁，病程2～12年。另有OA患者6例和无关节疾病的骨折患者4例作为对照。6例OA患者中男性2例，女性4例，年龄48～73岁，平均(60±11)岁，4例正常滑膜和软骨组织来自男性3名，女性1名。年龄24～52岁。所有滑膜组织切片均用苏木素—伊红(HE)染色。根据滑膜炎性细胞浸润程度，将滑膜炎记为l～3分:炎性浸润细胞＜25个/视野为1分;炎性浸润细胞25～100个/视野为2分;炎性浸润细胞＞100个/视野为3分［2］。RA及OA患者关节液均取自膝关节，为2009年9月直2010年5月川北医学院附属医院风湿科的住院病人，其中 RA患者26例，均符合1987年美国风湿病学会(ACR)分类标准，男性6例，女性20例，年龄45～72岁，平均(51±11)岁。另有OA患者19例，男性5例，女性14例，年龄55～76岁，平均(66±7)岁。采用无菌膝关节腔穿刺术，抽取关节液。1 500 r/min离心10分钟，－80℃保存备用。

1.2 主要试剂 DAB显色试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。皂素由BIO BASIC INC提供。鼠抗人DcR3 IgG单克隆抗体购自Santa Crutz公司。兔抗鼠二抗购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。DcR3 ELISA试剂盒购自博士德生物工程有限公司。

1.3 DcR3的检测 采用一步法免疫组织化学法检测滑膜组织中DcR3的表达。简要检测步骤为:①滑膜标本行冰冻切片，厚为5 μm，经丙酮(50%)+异丙醇(50%)(4℃预冷)固定15～30分钟;②加人0.2%皂素室温放置30～45分钟;③2%H2O2室温作用15分钟去除内源性过氧化物酶;④加入试剂盒中特异性多聚酶标记的鼠抗人单克隆一抗4℃过夜。以上各步骤之间均使用含0.02%吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤至少3次，每次5分钟;⑤加入二氨基联苯胺(DAB)应用液作用5～20分钟，显微镜下终止显色，苏木素复染。封片，显微镜下观察结果。同时设立阴性对照:分别PBS代替一抗，其余步骤不变。

1.4 染色结果判定标准 在免疫组织化学染色的滑膜和软骨组织，凡胞质中出现明显的棕黄色至黄粉色颗粒者为DcR3阳性细胞。并根据细胞形态，鉴别滑膜组织中的细胞类型，包括滑膜衬里层细胞(SLC)、滑膜下层巨噬细胞样细胞(MC)、成纤维样细胞(FB)、血管内皮细胞(VE)和单个核白细胞(MNC)。每张组织切片在400倍视野下根据随机计数原则确定显微镜的X轴和Y轴，随机采集5个视野图像，计算平均阳性细胞数分为5类:0:阳性细胞＜1%;1:阳性细胞占1% ～20%;2:阳性细胞占21% ～40%;3:阳性细胞占41% ～60%;4:阳性细胞＞60%。根据染色程度，将阳性信号分为4类:0分:没有着色;1分:染色强度弱;3分:黄至棕黄色染色;2分:染色强度介于弱阳性与强阳性之间。将染色强度记分×阳性细胞百分数记分，为每例组织染色的最后综合记分。综合记分≥1为表达阳性，＜1则为阴性。记录每个图像所有类型细胞的总数、阳性细胞数和阳性细胞类型，计算平均值。

1.5 ELISA检测关节液中DcR3的表达 按照试剂盒说明书进行配液，将标准蛋白及10倍稀释的关节液样本加入微孔板，加生物素-结合物(Biotinconjugate)孵育，洗板，加抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物(streptavidin-HRP)孵育，再洗板，加四甲基联苯胺(TMB)避光反应，加终止液终止反应，酶标仪450 nm处测量吸光值，由标准曲线求出各关节液样本中DcR3的浓度。

1.6 统计学处理 免疫组化结果采用两样本构成比(率)比较的χ2检验。ELISA结果采用t检验。应用SPSS10.0软件进行数据处理。

2 结果

2.1 DcR3在滑膜组织免疫组织化学染色结果RA、OA和正常滑膜组织DcR3的检测结果见表1和图1。图1为RA组、OA组及正常对照组滑膜组织DcR3表达的免疫组化图片。由表1可见，RA滑膜组织细胞中DcR3阳性细胞约为72%，主要分布于滑膜组织中滑膜衬里层细胞(SLC)、血管翳周围的血管内皮细胞(VE)和单个核白细胞(MNC)等;而OA组织中DcR3阳性细胞数量较RA明显减少。主要表达于滑膜衬里层细胞(SLC)和单个核白细胞(MNC)等，且阳性强度也较RA明显减弱;而正常滑膜组织中少见DcR3阳性表达的细胞。

2.2 滑膜组织中DcR3的表达与滑膜组织炎性病变程度的相关性研究 由图2可见DcR3的表达与滑膜组织的炎性程度成正相关关系(r=0.803，P＜0.01)。

2.3 RA与OA患者关节液中DcR3的表达量比较结果 由表2可见，RA及OA患者关节液中均可检测到DcR3的表达，但RA组表达量明显较高，与OA组比较差异具有统计学意义。

图1 滑膜组织免疫组化图片Fig.1 Immunohis tochemistry picture

表1 RA，OA和正常滑膜组织DcR3表达量比较Tab.1 The expression of DcR3 in synovial tissue of RA，OA and control groups

表2 RA与OA患者关节液中DcR3的表达量比较Tab.2 The expression of DcR3 in the synovia of RA and OA patients

3 讨论

诱骗受体3(DcR3，又称TR6)是1998年由Pitti等［2］发现的一种可溶性肿瘤坏死因子受体超家族成员，属于分泌性蛋白。其特点在于DcR3虽然可与肿瘤坏死因子Fas、HVEM、DR3竞争结合其相应配体FasL、LIGHT及TLIA，但由于缺乏胞内区或者由于胞内死亡区不完整，而不能传导凋亡信号，具有抑制细胞凋亡的作用，在细胞的生长、分化、死亡以及免疫调节等方面发挥重要作用，与多种疾病等密切相关。DcR3基因在人胚胎肺、脑、肝和成人脾、胃、结肠、肺、淋巴结、脊髓中存在低表达，但在人结肠癌细胞株SW480和SW1116中高表达。在人类恶性肿瘤如胃肠道肿瘤、肺癌、病毒相关淋巴瘤、原发性肝癌、胰腺癌、神经胶质瘤等及某些自身免疫疾病如进行性系统性硬化病、系统性红斑狼疮和矽肺患者的外周血单核细胞也能检测到DcR3的高表达［4-11］。

图2 DcR3与滑膜组织炎症程度的相关性Fig.2 The correlation of the DcR3 expression and inflammatory lesion in the synovium

类风湿关节炎是一种常见的炎性关节病，虽然其主要靶器官是滑膜组织。大量研究显示在RA的发病过程中关节局部的小分子炎症介质、细胞因子、生长因子、趋化因子、粘附分子、基质金属蛋白酶等吸引并活化来自外周血的炎症细胞，触发滑膜细胞的增殖和活化。病变随后表现出局部肿瘤的生物学行为，侵袭并损坏关节软骨、软骨下骨、肌腱和韧带。滑膜细胞周期失调及凋亡异常可导致关节滑膜组织过度增生、肥厚从而促进RA的发生［12］。DcR3可以在肿瘤细胞和恶性肿瘤组织中高表达，通过其抑制凋亡的作用参与肿瘤细胞的免疫逃逸。而病变的类风湿关节炎滑膜细胞在局部也表现了肿瘤的生物学行为，研究发现类风湿关节炎滑膜细胞同样存在凋亡不足的现象。Hayashi等［13］用ELISA的方法研究了OA和RA患者血清及关节液中DcR3的表达情况，结果发现RA患者血清及关节液中DcR3的浓度较OA组明显升高，且与TNFα的表达呈正相关，但与RA患者的病情活动无明显的相关性。Hayashi等［14］还用 RT-PCR和 Western blot的方法研究了RA及OA滑膜细胞中DcR3的表达，结果发现OA及RA患者的滑膜细胞中均表达DcR3，其表达量在两者没有明显的差异。作者进一步将DcR3融合蛋白与滑膜细胞共孵育并将DcR3 siRNA转染至滑膜细胞，结果发现将DcR3融合蛋白抑制了RA滑膜细胞Fas诱导的凋亡作用，但用siRNA沉默DcR3的表达后这种抑制作用明显减弱，而OA滑膜细胞没有该表现。我们前期的实验也已经通过ELISA的方法和荧光实时定量PCR的方法研究了RA患者DcR3在血清水平和基因水平与健康人群之间的差异［15］。研究发现DcR3在RA患者血清中表达的平均水平较健康对照组明显升高，但RA组各样本之间的差异较大，结合患者的DAS28评分比较显示，血清DcR3的表达水平可能与类风湿关节炎疾病活动有一定的相关性。而荧光实时定量PCR也发现在基因水平，RA组外周血单核细胞DcR3的表达水平较健康对照组明显升高，但与RA病情活动没有明显关系。

那么RA患者滑膜组织中是否能够检测到DcR3的表达呢?其表达特点是否也与血清中的表达特点一样与患者的病情活动度相关呢?在本文中，我们进一步运用免疫组织化学的方法研究了RA患者滑膜组织中DcR3的表达，并与OA患者及正常滑膜组织对照。研究发现RA患者滑膜组织中DcR3的表达量明显增高，并且与滑膜组织的炎性程度成正相关。同时我们运用ELISA的方法检测了关节液中DcR3蛋白的表达，也发现RA患者关节液中DcR3的表达量同样高于OA患者。以上提示我们RA患者滑膜组织DcR3的过度表达可能与RA滑膜炎的发病有一定的关系。但其是通过哪种通道来实现的，还有待于进一步研究。

1 Pitti R M，Marsters S A，Lawrence D A et al.Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer［J］.Nature，1998;396:699.

2 王丽萍，袁国华，王 轶et al.类风湿关节炎滑膜组织人糖皮质激素诱导型肿瘤坏死因子受体表达的组织化学研究［J］.中华风湿病学杂志，2009;13(4)13-14.

3 Bai C，Connolly B，Metzker M L et al.Overexpression of M68/DcR3 in human gastrointestinal tract tumors independent of gene amplification and its location in a four2gene cluster［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000;1297:1230.

4 Takahama Y，Yamada Y，Emoto K et al.The prognostic significance of over expression of the decoy receptor for decoy receptor for Fas ligand(DcR3)in patients with gastric carcinomas［J］.Gastric Cancer，2002;5(2):61-66.

5 LI H，Zhang L，Lou H et al.Over expression of decoy receptor 3 in precancerous lesions and adenocarcinoma of the esophagus［J］.Am J Clin Pathol，2005;124(2):282-287.

6 Yu Lian Wu，Bing Han，Sheng H et al.Clinical significance of detecting elevated serum DcR3 in malignant tumor patients［J］.Int J Cancer，2003;105(2):724-732.

7 Ohshima K，Haraoka S，Sugihara M et al.Amplification and expression of a decoy receptor for fas lifand(DcR3)in virus(EBV or HTLV-I)associated lymphomas［J］.Cancer Lett，2000;160(1):89-97.

8 Shen H W，Wu Y L，Peng S Y.Overexpression and genomic amplification of decoy receptor 3 in hepatocellular carcinoma and significance thereof［J］.Zhonghua Yi Xu Za Zhi，2003;83(9):744-777.

9 Tsujis S，Hosotani R，Yonehara S et al.Endogenous decoy recoy receptor 3 blocks the growth inhibition signals mediated by Fas ligand in human pancreatic adenocarcinoma［J］.Int J Cancer，2003;106(1):17-25.

10 Arakawa Y，Tachibana O，Hasegawa M et al.Frequent gene ampilication and over expression of decoy recoy receptor 3 in glioblastoma［J］.Acta Neuropathol(Berl)，2005;109(3):294-298.

11 Otsuki T，Tomokuni A，Sakaguehi H et al.Over-expression of the decoy receptor 3(DcR3)gene in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)derived from silicosis patients［J］.Clin Exp Immunol，2000;119(2):323-327.

12 高 娜，张 育.凋亡调节蛋白Survivin与类风湿关节炎［J］.中华风湿病学杂志，2007;11(11):690-693.

13 Hayashi S，Miura Y，Tateishi K et al.Decoy receptor 3 is highly expressed in patients with rheumatoid arthritis［J］.Mod Rheumatol，2010;20(1):63-68.

14 Hayashi S，Miura Y，Nishiyama T et al.Decoy receptor 3 expressed in rheumatoid synovial fibroblasts protects the cells against Fas-induced apoptosis［J］.Arthritis Rheum，2007;56(4):1067-1075.

15 陈安平，袁国华，向 阳.陷阱因子3在类风湿关节炎患者血清及外周血单核细胞中的表达研究［J］.中华风湿病学杂志，2012;(16)1:47-49.