刘志瑞,王德文,左红艳,王少霞,徐新萍,郭晓明,王静雯,曹桓荣
研究表明,在模拟深埋条件下发生的持续挤压伤复合低氧缺水缺食(复合组)大鼠于4.2~6.8天全部死亡,其肺脏功能(动脉血气参数PaCO2、PaO2)和结构(光镜、电镜、免疫组织化学等)均发生严重损伤,提示肺脏是其易受损的较敏感远隔器官之一,并具有病变高发性、进行性、全肺性等特点[1]。本文拟进一步结合灾害现场救援实际需要,通过肺重指数、常规宏观病理、光镜组织学病理等动态检测和观察,探讨模拟深埋条件下挤压伤复合低氧缺水缺食大鼠于3天解除挤压(即模拟“黄金抢救时间72 h”)即刻至28天的肺脏病理损伤的功能和病理变化,旨在为提高其获救后的现场救援,及完善后续救治水平、减少伤亡提供实验依据。
1.1 实验动物与分组 选用健康同龄Wistar雄性大鼠138只,体重(220±20)g,随机分为正常对照组(30只)、单纯挤压伤组(36只)、低氧缺水缺食组(三缺组36只)、挤压伤复合低氧缺水缺食组(复合组36只)。
1.2 动物模型建立 挤压伤复合低氧缺水缺食大鼠采用钳夹双后肢近端方法建立挤压伤模型,压力设置(4.5±0.3)kg。建模后与三缺组大鼠一并置入低氧生物医学实验舱内,将舱内氧气浓度维持在(10±0.1)%,禁食水,连续挤压、低氧72 h。于72 h后将大鼠从低氧舱中取出,置入常规氧环境中,并解除挤压,此后大鼠可自由进食水。单纯挤压伤组大鼠采用同样钳夹双后肢近端的方法建立挤压伤模型,可自由进食水。正常对照组未予任何处置。
1.3 宏观病理学观察 各组动物均于解除挤压并脱离低氧环境、自由进食水后即刻、第1天、第3天、第7天、第14天和第28天,经2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,称体重,开胸取肺脏,宏观观察肺部病变,称双肺重量,计算肺重-体重比值(肺指数,‰)。每组6只。
1.4 光镜病理组织学标本 切取上述各时间点肺脏组织标本,经10%缓冲福尔马林固定1周后,常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋,4μm厚制片,60℃温箱烤片1周。常规HE染色,光镜(DM3000,莱卡公司)观察并照相。
1.5 统计学方法 采用统计软件SPSS 16.0进行方差分析。数据以均数和标准差()表示。P<0.05差异显著,P<0.01差异非常显著。
2.1 死亡情况 复合组1只大鼠于解除挤压后15 h猝死(经死亡前心电图检测和死亡后病理学观察证实,主要死亡原因为心脏严重损伤、心功能紊乱所致)。单纯挤压伤组和三缺组大鼠未发生死亡。
2.2 挤压伤复合低氧缺水缺食 33天后解除挤压大鼠肺脏指数改变
2.2.1 大鼠体重变化 于解除挤压后即刻,所有实验组大鼠的体重均显著低于正常对照组(P<0.01),尤其复合组最为明显,同时显著低于单纯挤压伤组和三缺组(P<0.01);在解除挤压后第1天至第28天,各组体重均呈增长趋势,其中复合组在所有时间点的体重均最轻,体重增长最为缓慢,不仅显著低于正常对照组,同时也不同程度低于单纯挤压伤组、三缺组(P<0.05,P<0.01)。对解除挤压后第28天正常对照组、单纯挤压伤组、三缺组、复合组体重平均增长的累计值分别为155 g,106 g,225 g,122 g,可知三缺组体重增长最多,于第28天时其体重接近正常对照组,但复合组和单纯挤压伤组体重增长则较之缓慢,其体重远轻于正常对照组,尤其复合组更为显著。见图1。
图1 各组大鼠解除挤压后不同时间体重( g )比较
2.2.2 大鼠肺脏重量变化 于解除挤压后即刻至第28天,正常对照组、单纯挤压伤组、三缺组、复合组肺重均基本呈轻微增长趋势分别为0.46 g,0.48 g,0.47 g,0.42 g。各组之间两两比较,均无显著差异(P>0.05)。见图2。
图2 各组大鼠解除挤压后不同时间肺重( g)比较
2.2.3 大鼠肺脏指数变化 于解除挤压后即刻,3个实验组大鼠的肺脏指数均高于正常对照组,其中复合组和三缺组最为显著(P<0.01),尤其复合组更为显著(可能与其体重最低有关)。在解除挤压后第1天至第28天,复合组和单纯挤压伤组肺脏指数虽仍均显著高于正常对照组(P<0.05,P<0.01,可能与其体重增长缓慢有关),但均呈现逐渐降低和恢复趋势,尤其于第28天时最为明显;三缺组仅于解除挤压后第1天显著高于正常对照组(P<0.05),而从第3天至第28天则持续明显降低,并与正常对照组基本相似。见图3。
图3 各组大鼠解除挤压后不同时间肺指数(‰)比较
2.3 肺脏光镜所见
2.3.1 肺基本病变 正常对照组各不同时间大鼠的肺泡、各级细支气管和间质组织均为正常结构。见图4-1、5、9、13、17、21。单纯挤压伤组大鼠于解除挤压后即刻的肺组织仅见轻度~中度充血,肺泡隔轻度~中度增宽,肺泡腔缩小;第1天时轻微减轻;第3天时进一步减轻;第7天、第14天时明显减轻;第28天肺泡结构渐接近正常。见图4-2、6、10、14、18、22。三缺组大鼠于解除后即刻的肺组织同样仅见轻度~中度充血等血循环障碍病变,与单纯挤压伤组所见基本类似,较轻;第1天时已见较明显减轻;第3天时更明显减轻;第7天、第14天时渐趋接近正常;第28天基本恢复正常。见图4-3、7、11、15、19、23。复合组大鼠于解除后即刻的肺组织呈急性呼吸窘迫综合征(ARDS)样改变,主要为较广泛的中度~重度充血等血循环障碍,甚至血停滞,部分肺泡间隔增宽,少量红细胞渗出,偶见轻度水肿,并可见小叶局灶性间质性肺炎样病变;第1天、第3天时较之略减轻,局灶性水肿和出血仍较多见;第7天、第14天进一步减轻,局灶性水肿和出血仍可见;第28天时6只大鼠中5只仅见少数肺泡壁轻微的上述病变,多数肺泡结构明显恢复。见图4-4、8、12、16、20、24。只有1只大鼠的右肺部分病变仍未完全吸收。见图5。
表1 各组大鼠解除挤压后肺组织病变程度比较
2.3.2 肺病变程度分级 参照持续性挤压伤复合低氧缺水缺食病变程度的划分原则[3],本次解除挤压伤复合低氧缺水缺食实验中,各组不同时间肺组织损伤光镜下病理组织学变化程度比较。解除挤压后各实验组不同时间肺组织病变程度均呈减轻和恢复过程,其中复合组恢复最缓慢,第28天肺内仍见部分轻微局灶性病变,三缺组恢复最迅速,单纯挤压伤组介于期间。见表1。
3.1 关于挤压伤的动物模型 目前国内外关于挤压伤实验研究的动物模型种类较多,主要包括重物压迫法、气压止血带挤压法、甘油肌肉注射法等[2-5]。基于重物压迫法需要在麻醉状态下进行,既不同于灾害和事故实际,且难以实现进行长时间持续挤压条件以深入研究的需求;气压止血带挤压法和甘油肌肉注射法则难以接近现场和临床的实际。本实验首次设计和应用钳夹后肢方法成功建立了挤压伤模型,即在动物清醒状态下,应用自制的钳夹挤压器械,使挤压力量同时均匀作用于大鼠双后肢近端的方法,压力设置(4.5±0.3)kg,更为接近事故现场和临床实际,且具有简单易行,压力可调,并可进行长时间持续挤压所致伤肢局部病变(如坏死、溃烂、干枯、脱落等)和远隔脏器损伤效应(如挤压综合征等)动态研究的优点。同时,可持续挤压1~2周以上,进行生命耐受力全程研究,业已为千余只动物实验所证实。
3.2 关于本实验复合性挤压伤动物模型的伤情程度 本实验研究的伤类为模拟深埋条件下常见的挤压伤复合低氧缺水缺食模型(即该条件下特有的“复合性挤压伤”),基于双后肢挤压伤的伤情属于重度,氧浓度10%属于中度缺氧,并同时完全禁食禁水,结合前期本模型大鼠在持续挤压条件下于4.2~6.8天内全部死亡,平均存活时间仅(5.3±0.7)天的结果,参照复合伤损伤程度的划分原则和标准[6(]即两单伤或三单伤相互加重,综合伤情程度升级),本模型大鼠的损伤程度应属于极重度复合伤。需要补充的是本课题组在单后肢挤压伤(属于中度伤情)复合同样低氧缺水缺食模型实验中(其综合伤情程度为重度复合伤),在第7天时间内,死亡率仅为22.2%。
3.3 关于复合性挤压伤实验动物解除挤压时间的确立 迄今国内外采用重物或环周压迫法研究挤压伤及其挤压综合征的动物实验研究中,由于研究目的、动物种类和重物重量的不同,导致所应用的挤压时间也各异,大多采用挤压4 h法(即4 h后解除挤压),也有采用3 h法[7]、5 h法[5]、6 h法[8],10 h法[9]等。由于挤压时间的不同,成为所引起的挤压伤、挤压综合征、多器官功能不全综合征的伤情程度、伤类特点等差异的重要原因之一。特别是基于掩埋事件后现场抢救大多经历探寻、挖掘、破拆等过程,多数伤员只能在遭受掩埋一段长短不一的时间后方能获救得以解除挤压,故本实验采用了模拟目前国内外具有共识的“黄金抢救时间72 h”解除挤压的方法,以期更接近现场实际救援需求。
3.4 关于复合性挤压伤第 33天解除挤压后肺脏损伤的功能和病理特点 本研究通过解除挤压后即刻、第1天、第3天、第7天、第14天、第28天动态活杀大鼠,观测肺重、肺指数、宏观病理与光镜组织学病理,发现复合性挤压伤持续挤压3天时,其肺脏的基本病理变化呈ARDS样改变[10]:主要为较广泛的中度~重度充血等血循环障碍,甚至血停滞,部分肺泡间隔增宽,少量红细胞渗出,偶见轻度水肿,并伴小叶局灶性间质性肺炎病变。当解除挤压后,上述肺病变均呈现自发性逐渐减轻和恢复过程。其恢复过程具有如下特点。(1)初期病变的全肺性:即持续挤压3天时(解除挤压后即刻)肺脏的上述病变于全肺均可见到,其中双肺下叶较明显;(2)自行恢复的可能性:即解除挤压后虽未给予任何医学救治处置,上述肺脏病变均可自行减轻恢复;(3)恢复过程的缓慢性:即解除挤压后第1天至第3天时略减轻,第7天至第14天进一步减轻,水肿和出血渐减少减轻,第28天时部分大鼠未完全恢复正常。
基于肺脏不仅是机体具有呼吸功能(气体交换)的重要器官,而且也是某些激素和介质产生、诸多物质代谢和转化作用、影响体循环等多种功能的重要器官。此外,肺在凝血过程中也起重要作用[11],提示在频发的各类灾害而导致的人员掩埋(特别是深层掩埋)条件下,对此类伤员的现场急救和后续治疗过程中,加强肺脏保护,促进损伤修复,是减轻、减少并发症,提高存活率的重要环节之一。
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