补肾解毒方与健脾解毒方含药血浆对慢性乙肝病毒感染不同免疫状态患者外周血T细胞功能的影响

欧 松，孙克伟，彭建平，祁双林，闻 杰，胡 莉

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

乙型肝炎病毒（HBV）感染后慢性乙型肝炎患者外周血免疫细胞均存在着免疫功能缺陷或低下，其中，以T 淋巴细胞功能低下为中心的细胞免疫功能障碍导致的免疫耐受是HBV 持续感染、慢性乙型肝炎难以治愈的主要原因[1]。既往研究表明中医药在改善机体免疫状态，恢复和提高免疫细胞功能，重建免疫应答具有较好的作用[2-4]。针对HBV 慢性感染其外因是湿热疫毒内侵，内因归属脾、肾二脏亏虚[5]，本研究拟运用HBV 感染免疫耐受期与免疫清除期患者外周血T 细胞体外培养的细胞模型和中药血浆药理实验方法，比较补肾解毒方和健脾解毒方对HBV感染不同免疫状态患者的外周血T 细胞功能的影响，为临床提高中医药治疗慢性乙型肝炎的疗效提供指导思路和研究基础。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD大鼠30只，雌雄各半，41 d 龄，（164.2±10.6）g，湖南中医药大学动物学部提供，使用许可证号：SCXK (湘)2009-0004。实验大鼠于2010年9月24日至2010年10月6日在湖南中医药大学动物学部SPF 级饲养房喂养。

1.2 药物

补肾解毒方：六味地黄丸（《小儿药证直诀·卷下》[6]）加甘露消毒丹（《温热经纬》[7]）化裁：熟地黄24 g，山药12 g，山茱萸12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，白蔻仁10 g，藿香10 g，茵陈15 g，滑石30 g，石菖蒲10 g，黄芩10 g，连翘10 g，川贝母10 g，射干10 g，薄荷6 g；健脾解毒方：四君子汤（《太平惠民和剂局方》[8]）加甘露消毒丹化裁：人参、白术、茯苓、炙甘草各9 g，白蔻仁10 g，藿香10 g，茵陈15 g，滑石30 g，石菖蒲10 g，黄芩10 g，连翘10 g，川贝母10 g，射干10 g，薄荷6 g。饮片均采用道地药材，由长沙九芝堂股份有限公司提供，由湖南中医药大学第一附属医院制备，补肾解毒小、中剂量组分别含生药1.94、9.71 g/mL；健脾解毒小、中剂量组分别含生药1.58、7.92 g/mL。

1.3 试剂与仪器

BS 缓冲液：天津津脉；淋巴细胞分离液：天津灏洋公司；RPMI1640：吉诺生物医药技术有限公司；10%胎牛血清(FCS)：美国Hyclone 公司；1%多聚甲醛:天津市化学试剂研究所；荧光抗体CD3-Percp(多甲藻叶绿素蛋白)，CD4-FITC （异硫氰酸荧光素)，CD8-PE（藻红蛋白荧光素），CD28-FITC，同型对照IgG2a-Percp，IgG1-FITC，IgG2a-PE，均购自美国ebioscience 公司；水套式CO2培养箱（中国力康发展有限公司）、倒置生物显微镜XD-202 型(南京江南永新光学有限公司)、FACS Calibur 流式细胞仪(BD亚洲有限公司)。

1.4 T 细胞分离与培养

选择36 例湖南中医药大学第一附属医院感染科2010年6月至2011年5月门诊HBV 慢性感染患者，均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[9]诊断标准，均签署知情同意书。根据免疫状态分为免疫耐受组和免疫清除组，其中免疫耐受组18 例，男12 例，女6 例，平均年龄（28.5±4.56）岁，病程7～22年，平均病程（11.6±4.6）年；免疫清除组18 例，男11 例，女7例，平均年龄（30.2±2.65）岁，病程8～20年，平均病程（12.8±3.4）年。另选择10 名湖南中医药大学健康学生及湖南中医药大学第一附属医院健康职工作为健康组，其中男6 例，女4 例，平均年龄（25.7±3.5）岁。各组一般资料比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）。运用密度梯度离心法，无菌条件下抽取人外周血20 mL，肝素抗凝（50 u/mL），PBS 对倍(1∶1)稀释，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)，PBS 洗涤2次，RPMI1640 洗 涤1 次。再 用RPMI1640 液 悬 浮PBMCs，注入T 细胞尼龙毛柱，37 ℃、5%CO2培养箱孵育4 h，冲洗出非粘附细胞即为自体T 淋巴细胞。最后用含体积分数为10%的胎牛血清RPMI-1640培养基悬浮细胞，调整外周血PBMCs 终浓度为2×106/L 于6 孔培养板内，置37 ℃、5%CO2培养箱进一步培养。

1.5 动物分组及干预方法

SD 大鼠随机分为5 组：正常对照组(10 只)、补肾解毒小剂量组(5 只，1.94 g/mL)、补肾解毒中剂量组 (5 只，9.71 g/mL)、健脾解毒小剂量组 (5 只，1.58 g/mL)、健脾解毒中剂量组(5 只，7.92 g/mL)。SD大鼠灌胃量按体表面积法换算，小剂量相当于成人临床用药量6.562 倍[10]，其5 倍剂量为中剂量。具体灌胃干预措施及大鼠含药血浆制备均按文献[11-12]方法进行。正常对照组采用等量生理盐水灌胃。每天上午8：00、下午5：00 灌胃，每次灌胃量为1 mL，连续3 d，第4 天上午灌胃后1～2 h 内取血。采血前12 h 禁食，自由饮水，1%戊巴比妥腹腔注射麻醉（45 mg/kg），待麻醉满意后开腹，分离腹主动脉，持采血针刺入腹主动脉，接负压肝素抗凝管取血，每只大鼠采血约10 mL，2 500 r/min 离心20 min，取血浆，0.22 μm 滤膜滤过除菌，将血浆分装至1.5 mL EP 管中，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.6 最佳血浆培养浓度的确定

采用MTT 法收集分离培养成熟的T 细胞，用预热的RPMI1640 培养液洗涤细胞2 次，用完全培养液配制成单个细胞悬液，以2×105/mL 接种96 孔培养板，每孔100 μL，分别加入含药血浆5、10、20 μL，使终浓度分别为5%、10%、20%，每一浓度同时设3 个复孔。正常对照组大鼠血浆为正常对照孔，5%CO2、37 ℃饱和湿度孵育48 h。每孔加入20 μL(5 g／L) MTT 溶液，继续孵育4 h，弃上清液，加入200 μL DMSO 振荡10 min，在酶标仪上选择492 nm 波长，以630 nm 波长为参照波长，测定各孔吸光度值(OD 值)。选择T 细胞生存率最高的血浆浓度作为干预浓度。T 细胞生存率=药物干预组／正常对照组OD 值×100%。

1.7 含药血浆干预

于培养第1 天收集DCs 细胞，同以上操作配制2×105/mL 单个细胞悬液。取1 mL T 细胞悬液，用于干预前T 细胞功能检测。其余T 细胞悬液各取出1／3，分别以最佳血浆培养浓度的药物血浆进行干预，37 ℃、5%CO2培养箱继续培养48 h 后进行T 细胞功能检测。剩余1／3 T 细胞悬液加入等浓度的空白血浆作为空白血浆组。选择OD 值最高的空白血浆浓度，即添加浓度为20%含药血浆浓度作为计算生存率的空白血浆组的0D 值。经计算，使T 细胞生存率最高的血浆浓度分别为10%补肾解毒中剂量组（96.0%）和10%健脾解毒小剂量组（95.3%）。将以上两个浓度作为正式实验的干预浓度。依据目前国内学者报道的药物血浆最佳培养时间48 h 作为进一步研究的培养时间[13]。

1.8 指标检测及方法

1.8.1 T 细胞表面分子表达检测 取制备好的T 细胞悬液，加入l.5 mL EP 管中，分6 管，每管200 μL，分别加入荧光标记鼠抗人CD3-Percp (多甲藻叶绿素蛋白)，CD4-FITC（异硫氰酸荧光素)，CD8-PE（藻红蛋白荧光素），CD28-FITC 各20 μL，轻轻混匀，4 ℃孵育30 min，再用PBS 洗细胞2 次以去除未结合的游离单抗，最后以1%多聚甲醛500 μL重悬固定细胞，并用Percp、FITC、PE 标记的鼠抗人IgG 作对照。用流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+、CD28+的表达水平。

1.8.2 干扰素-γ（IFN-γ）的水平检测采用ELISA 法检测T 细胞培养上清液IFN-γ 水平，按试剂盒说明书操作。

1.9 统计学方法

数据采用SPSS 13.0 统计软件，计量资料实验结果以 “±s” 表示，先进行正态性及方差齐性检验，两组间比较满足正态性及方差齐性时用成组t检验，方差不齐时用t＇ 检验；多组间比较用方差分析，两两比较用q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组各时间点CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表达比较

两组CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表达较健康组均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组健脾解毒药物血浆与补肾解毒药物血浆干预后CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+分子表达均有升高，与干预前比差异有统计学意义（P＜0.05）；免疫耐受组中，补肾解毒药物血浆干预后CD8+及CD28+分子表达高于健脾解毒组 （P＜0.05）；两种药物血浆分别干预后，CD28+分子表达均高于免疫清除组同期。见表1。

表1 各组各时间点CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表达比较 （%，±s）

表1 各组各时间点CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表达比较 （%，±s）

注：与本组干预前比较*P＜0.05；与相同免疫状态健脾解毒组比较△P＜0.05；与免疫清除组同期比较▲P＜0.05；与健康组比较▽P＜0.05。

组 别 n 剂 量(g/mL) 时 间 CD 3 CD4 CD8 CD28 免 疫 耐 受 18 干 预 前 58.05±4.40 34.45±2.55 29.62±3.11 44.36±3.43 空白血浆 18 — 干预后 57.43±2.87 32.67±3.53 29.34±4.16 44.53±3.43 补 肾 解 毒 18 9.71 干 预 后 64.35±2.34 39.23±3.48 34.23±2.15 52.40±2.35健 脾 解 毒 18 1.58 干 预 后 63.58±3.16 38.52±2.32 32.06±1.28 49.26±2.74 免 疫 清 除 18 干 预 前 62.29±3.60 37.34±4.16 30.82±1.98 45.76±4.31 空白血浆 18 — 干预后 61.62±2.73 36.03±3.46 29.53±4.36 45.78±3.63 补 肾 解 毒 18 9.71 干 预 后 64.35±2.63 40.13±2.52 32.64±3.53 48.26±2.38 健 脾 解 毒 18 1.58 干 预 后 64.26±2.37 39.37±2.34 32.78±4.21 47.32±3.23 健康 10 — 干预前 67.13±2.26 44.80±3.06 35.09±2.32 55.70±2.28

2.2 含药血浆干预前后T 细胞分泌的IFN-γ 水平

含药血浆干预前两组IFN-γ 水平较健康组均偏低，差异有统计学意义（P＜0.05）；药物血浆干预后，IFN-γ 水平较干预前均有升高（P＜0.05），两组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组干预前后IFN-γ 水平比较 （ng/L，±s）

表2 各组干预前后IFN-γ 水平比较 （ng/L，±s）

注：与健康组比较*P＜0.05；与本组干预前比较△P＜0.05；与免疫清除组比较▲P＜0.05。

组别免疫耐受免疫清除健康n 18 18 10干预前275.64±47.32*▲286.73±43.64*334.50±43.28干预后补肾解毒 健脾解毒293.45±45.36△ 291.66±44.53△294.37±42.34△ 293.36±43.55△334.23±42.35 333.26±41.56

3 讨论

近年来研究发现突破免疫耐受，清除病毒关键在于启动或激发机体特异性的细胞免疫反应，而细胞免疫反应的强弱与机体免疫细胞功能状态密切相关。HBV 感染人体后，机体主要依靠细胞毒效应与非细胞毒效应两种免疫机制清除病毒，其中T 淋巴细胞参与的细胞毒效应起主要作用。机体的特异性细胞免疫包括CD8+细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助性T 淋巴细胞(Th)。CD4+T 淋巴细胞是机体抗病毒免疫应答的中心环节，其数量的下降可直接影响免疫调节功能，造成宿主体液免疫和细胞免疫缺陷，最终导致患者体内HBV 清除缓慢而不彻底[14]。CD8+T 淋巴细胞有直接被HBV 感染的肝细胞激活的特性，作为免疫应答损害被感染的肝细胞，同时也清除病毒。因此，HBV 感染患者T 淋巴细胞亚群CD4+和CD8+是反映机体免疫状态和功能的重要指标，对HBV 的感染及乙肝的慢性化有重要意义，在一定程度上可以反映机体细胞免疫调节功能。此外，CD28+是T 淋巴细胞表面重要的共刺激分子，它参与T 细胞活化信号的转导，使T 细胞活化、增殖、启动和维持免疫应答。因此，它对于诱导和维持T 细胞介导的免疫应答具有十分重要作用[15-16]。

慢性HBV 感染属中医学 “黄疸”、“胁痛”、“臌胀”、“积聚”等范畴，其外因是湿热疫毒内侵，内因归属脾肾二脏亏虚[5]。病理基础属于本虚标实，在正邪斗争的过程中，机体的免疫功能处于紊乱状态，正气亏虚不能完全行使清除邪气(HBV)的功能，病理状态得不到修复，致使疾病缠绵难愈。标本兼治符合慢性HBV 感染病因病机，本实验采用补肾解毒方和健脾解毒方干预HBV 慢性感染患者外周血T 淋巴细胞，探讨两种治法对HBV 慢性感染不同状态T淋巴细胞功能的影响，不仅有利于进一步明确慢性HBV 感染患者发病的中医脏腑病机，而且为临床治疗慢性HBV 感染患者提供科学可靠的治疗思路和实验基础。

本研究发现，免疫耐受组与免疫清除组两组CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表达较健康组均下降，说明慢性HBV 感染患者机体T 淋巴细胞表达低下，存在免疫功能缺陷或不足。各组健脾解毒药物血浆与补肾解毒药物血浆干预后CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+分子表达均有升高，而免疫耐受组中，补肾解毒药物血浆干预后CD8+及CD28+分子表达高于健脾解毒组，同时两种药物血浆分别干预后，CD28+分子表达均高于免疫清除组同期。此外，含药血浆干预前两组IFN-γ 水平较健康组均偏低，而药物血浆干预后，IFN-γ 水平较干预前均有升高。由此证实两种药物血浆干预均能促进T 淋巴细胞表面分子的表达，通过补肾解毒方与健脾解毒方在一定程度上可以促进机体免疫功能的改善或恢复，并且补肾解毒方药物血浆更能促进T 淋巴细胞的表达，为今后慢性HBV 感染的临床治疗提供了可靠的实验依据与方向。本实验只选取了一些指标进行观察，且样本量有限，不能全面反映慢性HBV 感染患者机体免疫功能状态，且未做临床多中心研究，有待在今后的实验和临床中进一步完善。

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