护卵汤对GnRHa超排卵大鼠卵巢细胞凋亡及活胎率的影响

申可佳，熊 桀，尤昭玲，雷 磊，邱苒苒，游 卉，付灵梅

（1 湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2 湖南中医药大学附属一医院，湖南 长沙410208）

卵巢内颗粒细胞-卵母细胞及颗粒细胞-卵泡膜细胞的信号交流是卵母细胞发育成熟的重要条件，颗粒细胞及卵泡膜细胞的生长或凋亡对卵泡发育及卵母细胞的质量起着举足轻重的作用。我们的前期工作发现护卵汤能改善促性腺激素释放激素（GnRHa）超排卵大鼠的卵泡发育及卵子质量，影响体内生殖激素水平[1-2]，本实验进一步观察护卵汤对GnRHa 超排卵大鼠卵巢细胞凋亡及妊娠结局的影响。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康8 周龄SPF 级雌性SD 大鼠90只，体质量为180～220 g。第3 周购入成年雄性大鼠20 只。以上动物均由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物合格许可证号：SCXK（湘）2009-0004。

1.1.2 药物 护卵汤颗粒，由广东一方制药有限公司生产提供，每剂的总质量为17.1 g，相当于生药量116 g（熟地黄10 g，生地黄10 g，沙参10 g，石斛10 g，山药10 g，莲子肉10 g，桑椹子10 g，覆盆子10 g，菟丝子10 g，月季花10 g，莲心3 g，肉苁蓉10 g，甘草3 g）；注射用促性腺激素释放激素（Gn-RHa）：马鞍山丰原制药有限公司生产，批号1005265；注射用尿促性腺激素（HMG）：中国丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司生产，批号1007234；注射用绒毛膜促性腺激素（HCG）：中国丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司生产，批号1006137。

1.1.3 试剂 细胞凋亡检测试剂盒，4%多聚甲醛，磷酸盐缓冲液（PBS），蒸馏水，双氧水（H2O2），SABC染色液，DAB 显色液，苏木素，25%乌拉坦等，购自武汉Boster 公司、湖南丽欣生物有限公司或自己配制。

1.1.4 仪器 光学显微镜（日本Olympus）；石蜡切片机（英国Shandon325）；Motic B5 显微图像摄相系统（麦克奥迪实业集团公司）；图像分析软件（美国Image-Pro Plus 6.0）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药方法 将大鼠随机分为5组：正常组，模型组，护卵汤低、中、高剂量组，各组给予正常喂养，均在每天上午7:30～8:30 行阴道涂片、染色及镜检。各组雌鼠均在阴道涂片发现进入动情后期当天开始用药[1]。大鼠用药剂量参照徐叔云等[3]方法，按70 kg 成人体表面积换算。其中模型组模仿人类GnRHa 长方案建立超排卵大鼠模型（从动情后期当天开始，每天腹腔注射GnRHa 2.7 μg/200 g，连续注射9 d，第9 天同时注射HMG 4.1 IU/200 g 1 次，48 h 后注射HCG 180 IU/200 g 1 次）；护卵汤各剂量组在模型组基础上加用不同剂量的护卵汤（低、中、高剂量组从动情后期当天开始至第11 天，每天上午分别给予护卵汤1.6、3.1、6.2 g/kg 灌胃），模型组、正常组每天在相应时间给予等量生理盐水腹腔注射和灌胃。

1.2.2 标本采集 在注射HCG 后4 h 用25%乌拉坦麻醉大鼠，动物天平称体质量后固定于鼠板，剪开大鼠腹膜，沿双侧子宫角上行，分别找到双侧卵巢，摘取双侧卵巢并去除表面脂肪组织。每组余下的雌鼠在注射HCG 后当天与雄鼠以2∶1 比例合笼过夜，次日早晨7∶00 检查雌鼠，若发现阴栓或阴道分泌物涂片中有精子记为孕1 d，常规饲养至孕12 d，用25%乌拉坦麻醉后固定于鼠板，剪开大鼠腹膜，取出双侧子宫，计数宫内活胎数和总胎数，计算每组妊娠大鼠的总活胎率=[总活胎数/总胎数]×100%。

1.2.3 卵巢细胞凋亡检测 将取出的卵巢组织按TUNEL 法进行细胞凋亡检测操作，置于显微镜下观察，细胞核有棕黄色颗粒者为凋亡细胞，未凋亡细胞呈蓝色。使用图像分析软件观察结果，随机选取5个高倍视野（400 倍），计数200 个细胞中的凋亡细胞数，并计算细胞凋亡率[4]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HCG 注射后当日各组大鼠卵巢细胞凋亡率

模型组及护卵汤各剂量组的卵巢体细胞凋亡率比正常组显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。护卵汤各剂量组的卵巢体细胞凋亡率均比模型组降低，差异有统计学意义（P＜0.01 或0.05）。结果见表1及图1。

表1 HCG日各组大鼠卵巢体细胞凋亡率 （n=8，±s）

表1 HCG日各组大鼠卵巢体细胞凋亡率 （n=8，±s）

注：与模型组比较★P＜0.05，★★P＜0.01；与正常组比较▲▲P＜0.01。

组 别正常组模型组护卵汤低剂量组护卵汤中剂量组护卵汤高剂量组药物剂量（g／kg）--1.6 3.1 6.2凋亡率（%）5.50±1.10 16.75±3.06▲▲13.13±2.95★▲▲12.56±2.69★▲▲11.13±2.80★★▲▲

2.2 孕12 d 妊娠大鼠的总活胎率

孕12 d 各组妊娠大鼠的总活胎率如表2所示，经统计学分析各组之间的数据没有统计学意义。

表2 孕12 d 各组大鼠妊娠总活胎率比较

图1 各组大鼠卵巢细胞凋亡光镜图（TUNEL ×400）

3 讨论

细胞凋亡（apoptosis）是在特定信号的诱导下，一系列基因按程序时空顺序表达，引起细胞内死亡级联反应，导致自主性程序性的细胞死亡。在成人的卵巢组织，细胞凋亡发生在闭锁卵泡或发育异常的卵泡，正常健康的卵泡不会观察到细胞凋亡现象；且细胞凋亡首先发生在颗粒细胞中，随后也出现于膜细胞层中，其主要累及的是卵巢颗粒细胞和间质细胞而非卵母细胞[6]。由于细胞凋亡早期就有DNA断裂，故TUNEL 法可以检测到早期的细胞凋亡，本实验采用TUNEL 法检测卵巢体细胞凋亡，具有灵敏度高、操作简单快速、观察方便（可用光学显微镜观察实验结果）等优点。多项研究表明[7-12]，卵泡颗粒细胞凋亡率与卵母细胞的质量及胚胎的体外发育潜能相关，与IVF 获卵数、受精率及妊娠结局相关，超排卵周期增高的卵泡颗粒细胞凋亡率会影响卵子质量及妊娠率。本实验结果发现模型组及护卵汤各剂量组大鼠的卵巢体细胞凋亡率比正常组显著增高，证实超排卵周期卵巢体细胞凋亡率较自然周期增高，与文献报道一致，并且是导致模型组大鼠排卵前优质卵泡率较正常组下降、卵母细胞超微结构异常[1]的原因。而护卵汤各剂量组均能有效减少GnRHa 超排卵大鼠卵巢体细胞的凋亡，这提示中药护卵汤参与GnRHa 超排卵治疗，能促进卵泡发育及提高卵母细胞的质量，与前期结果相符[1]。观察孕12 d 各组妊娠大鼠的总活胎率发现，模型组的总活胎率低于其它各组，但经统计学分析无统计学意义，各组之间活胎率差异性不显著可能与样本量偏小有关，在下一步的实验中增加样本例数应该更能说明护卵汤对各组大鼠活胎率的影响

综合本次实验和前期实验结果可得出结论：GnRHa 超排卵增加大鼠卵巢体细胞凋亡，对卵泡发育有不利影响；而护卵汤能减少GnRHa 超排卵大鼠卵巢体细胞的凋亡，促进卵泡发育及提高卵母细胞的质量。

［1］申可佳，尤昭玲，熊 桀，等.护卵汤对GnRHa 超排卵大鼠卵巢形态的影响［J］.湖南中医药大学学报，2012，32（9）：25-28.

［2］申可佳，熊 桀，尤昭玲，等.护卵汤对GnRHa 超排卵大鼠血清生殖激素的影响［J］.湖南中医药大学学报，2012，32（12）：

［3］徐叔云，卞如濂，陈 修，等.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出社，1982：1 184.

［4］王 玲.从调节卵巢细胞凋亡探讨左归丸治疗免疫性卵巢早衰的机制［D］.广州中医药大学，2007.

［5］丁 峰，陈士岭，邢福祺.卵泡闭锁调控机制研究进展［J］.国外医学·遗传学分册，1999，22（2）：88-91.

［6］Ana Clavero，Jose A Castillab，Ana I Nunez.Apoptosis in human granulose cells after induction of ovulation in women participating in an intracytoplasmic sperm injection program ［J］.Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology，2003，110：181-185.

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