紫竹PPO基因的生物信息学及表达分析

关 鹰，王 弋，郭小勤，林新春，方 伟

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）是一种能与Cu鏊合的膜结合蛋白，于1895年被发现，广泛分布于动物、植物、真菌和细菌中[1]。多酚氧化酶有三种类型，分别为酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶和漆酶。植物中，多酚氧化酶参与生物合成、光合作用、植物抗逆及褐化等过程[2]，尤其是在酶促褐变过程中，多酚氧化酶起关键作用[3]，它能作用于底物酚类物质而引起材料的褐化[4]。近几十年来，研究人员除了对多种植物的多酚氧化酶进行研究外，还克隆了编码基因，并对这些基因的结构、表达情况及功能进行了分析。

本实验从紫竹（Phyllostachys nigra）栽培类型一年紫中克隆了该基因的片段，对其序列分析显示，该序列与此前从台湾紫竹中获得的另一个同源基因片段有一定的差异，显示出该基因在不同栽培类型中具多态性。组织特异性分析结果显示，该基因在一年紫幼嫩部位的表达量高于其他成熟组织。

1 材料与方法

1.1 材料

在浙江农林大学翠竹园采集一年生紫竹的幼嫩叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，－20℃保存备用。在同一株上采集茎、笋尖、全笋、鞭根、叶芽，采用Trizol法提取其总RNA，－70℃保存备用。

1.2 紫竹PnPPO1基因片段的克隆

利用Primer软件参照GeneBank上所登录的PPO基因保守序列设计兼并引物，PnPPO1上游引物：5'-TTCGCGCTGCCGTTCTGGAA-3'，下游引物：5'-GATGTGCCACATGCGGTCGA-3'。PCR反应体系（20 μL）为：10×PCR buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，上游引物（10 μmol/L）2 μL，下游引物（10 μmol/L）2 μL，Taq DNA聚合酶 0.15 μL，模板DNA 1.0 μL（100 ng），ddH2O 12.45 μL。PnPPO1反应程序为：94℃：3 min，94℃：30 s，50℃：30 s，72℃：1 min，38个循环，72℃：5 min，4℃保温。琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。用鼎国XA014-1胶回收试剂盒对目的片段进行割胶回收，连接到pMD20-T载体（大连宝生物公司），连接产物转化感受细胞DH5α，挑取白斑，提取质粒，并进行酶切检测，确定结果正确后进行测序。

1.3 紫竹PnPPO1基因的组织特异性表达分析

以所提取的茎，笋尖，全笋，鞭根，叶芽的总RNA为材料，参照试剂说明书分别进行反转录，采用半定量PCR法对紫竹上述部位PnPPO1基因的表达进行分析。以β-actin基因为内标。β-actin反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，27个循环，72℃延伸5 min。PnPPO1反应程序如上，循环数为28循环。

2 结果与分析

2.1 PnPPO1基因片段的克隆及序列分析

以紫竹一年紫嫩叶 cDNA为模板，以PnPO1引物进行扩增，将扩增产物回收，转化，测序，测序结果显示该片段长438 bp，核苷酸序列比对结果发现，该序列为PPO同源基因，该基因与水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestiv）、莲（Nelumbo nucifera）、荔枝（Litchi chinensis）、玉米（Zea mays）等植物的PPO基因序列有很高的同源性，其中与小麦的同源性达到 75%，故将其命名为PnPPO1。DNAMAN分析显示，该片段编码146个氨基酸（图1），蛋白分子量约为36.2 kD，等电点为5.03。Blastp结果显示，该蛋白属于酪氨酸酶（图2），具有PPO蛋白典型的特征，含有1个保守的CuB结合区，进一步分析发现，在该区域有4个保守的H（His）和一个F（Phe）（图1）。

图1 PnPPO1 cDNA及氨基酸序列Figure1 cDNA and amino acid sequence of PnPPO1

图2 PnPPO1基因编码的部分氨基酸序列的比对结果Figure2 The blastp of PnPPO1partial amino acid sequence

利用ProtParam对PnPPO1氨基酸序列的理化性质进行在线预测，该氨基酸序列不稳定指数较高（表1）。利用TMHMM2.0在线预测了PnPPO1的跨膜情况，结果显示，PnPPO1蛋白在该区段没有发现跨膜位点并且膜外概率高于膜内，PPO蛋白有可能是一个膜外蛋白（图3）。

表1 一年紫PnPPO1氨基酸残基理化性质分析Table1 Physio-chemical characteristics analysis of PnPPO1 amino acids

运用ProtScale对PnPPO1的氨基酸残基进行疏水性分析显示，总体上亲水氨基酸明显多于疏水氨基酸（图4），说明一年紫PnPPO1蛋白在该区域显示较高的亲水性。

另外，所扩增到的该氨基酸片段具有α-螺旋（含量10.28%），β-折叠（4.79%）且α-螺旋串通不同长度的无规则卷曲（84.93%）。

对从一年紫和台湾紫中获得两条PPO序列进行分析，比对结果显示，两者同源性为86.45%，两序列间除了片段缺失外，还存在明显的 SNP位点，多态性频率为 1 SNP/27.3bp，其中以A/G转换类型最多，占81.25%。由于单碱基的变异，一年紫和台湾紫中酶切位点也会发生变化，从图4中可以看出，由于单核苷酸的变异，有6处酶切位点发生了变化，其中5处为新酶切位点的产生，1处表现为酶切位点的变换（图5）。

图3 一年紫PnPPO1跨膜预测Figure3 Predicted transmembrane of PnPP01

2.2 PnPPO1基因的组织特异性表达

为研究PnPPO1基因在一年紫不同组织部位中的表达情况，以β-actin基因为对照，对PnPPO1进行RT-PCR分析，结果如图6。由图6可知，在所检测的5个组织中，该基因在叶芽中的表达量最高，在鞭根中微量表达，而在其余的组织未检测到其表达。

图4 一年紫PnPPO1基因保守区推断的氨基酸序列疏水图Figure4 Hydrophobic analysis of on amino acids in the PnPPO1 sequence

图5 一年紫PnPPO1与台湾紫PnPPO的序列比对Figure5 Alignment sequence between PnPPO1and PnPPO1

图6 PnPPO1的组织特异性表达Figure6 Expression pattern of PnPPO1

3 结论与讨论

本研究利用同源克隆技术从一年紫嫩叶中获得PnPPO1的cDNA序列，与之前从台湾紫中获得的序列的同源性为 86.45%，两序列间除了碱基缺失外，还存在有丰富的SNP位点，且以A/G型转换位点最丰富。研究表明，PPO蛋白具有3个Cu结合区域（CuA、CuB、CuC），CuA与PPO的水溶性有关，CuB是底物结合的最关键区域，CuC与分子氧相连且调节叶绿体中有害光氧化反应，参与电子传递，起能量转换作用[5]。在实验获得的146个氨基酸残基中存在有CuB区域，该区域包含有保守的5个H（His），一个F（Phe），二级结构分析发现，本实验中所获得的一年紫PnPPO1蛋白片段中含2个α-螺旋（含量10.27%），1个β-折叠（4.79%）串通不同长度的无规则卷曲（84.93%）。

PPO是一种质体酶，它在植物中的分布有两个特点：一是常存在于光合组织和非光合质体中，二是在植物的幼嫩部分含量比较高[6]。研究表明，在不同物种、组织和发育阶段，PPO的表达水平存在较大差异[7]，如番茄中，该基因仅在叶片发育后期的栅栏细胞中表达，而蛋白主要存在于嫩叶、花、根形态建成等时期的表皮细胞中，随着叶片的发育成熟，几乎检测不到该蛋白的存在[8]。在马铃薯中，该基因仅在顶端的四个叶节点上能检测到表达，而其蛋白存在于所有的叶节点上。在莲藕中，该基因在整个供试组织中都有表达，但在茎尖和幼叶中表达量最高，其次为新鲜的莲藕切片，而在花瓣和茎秆中表达量最低[9]。本研究结果表明，一年紫中PnPPO1在叶芽中表达量最高，在鞭根中微量表达，而在其余组织中未检测表达，推测PnPPO1先在叶芽中表达，然后再分配到各组织中，在特定的时空下被激活并担负相应的功能。

致谢：感谢浙江农林大学特聘教授郑康乐在实验和论文写作中提出的宝贵建议和意见。

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