BHK21悬浮细胞在2～8℃下短期保存的研究

贾 英，赵丽霞，冯俊林，李超华，韩四娥

(内蒙古金宇保灵生物药品有限公司，呼和浩特010030)

细胞的最适温度范围很小，如哺乳动物细胞的最适温度为37℃。绝大部分细胞的最适生长温度是(37±0.5)℃，而细胞存活的温度范围相对来说大了很多。细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强，降低温度它们仍能生长，但速度变慢，如细胞在-196℃能保存数年甚至更长时间[1]。在生产中，有时会由于不可控因素导致紧急停产和培养细胞的短时间保存，然后需要快速复活。与种细胞常规复活方法相比，冷藏保存BHK21细胞悬液能快速满足大生产的种细胞需求，大大缩短了生产启动周期，适合动物细胞大规模培养[2]。生产中为了使细胞的生长状态更好且能够稳定传代，同时避免污染或发生细胞变异，需要不断地更换新种子，因此就需要一种快速有效的复活手段更换现有细胞，存放悬液无疑是一种既快又方便的方法[3]。

1 材料与方法

1.1 主要材料 BHK21悬浮细胞(金宇保灵生物药品有限公司)，5 L反应器(上海傲中)，倒置显微镜(XDS-1B)，血球计数板(XB-K-25QIUJING)，2～8℃冰箱(中国海尔)，取样瓶(SCHOTT 250 mL)。

1.2 实验方法 用5 L反应器接种BHK21悬浮细胞，在温度为37℃、pH为7.1、溶解氧为60%的条件下进行培养。培养到细胞密度5×106cells/mL左右时，无菌分取5个样品于灭菌的50 mL取样瓶中，每瓶30 mL，第一瓶为细胞原样(记为0 h)，检测细胞密度和细胞活力，其余样品置于2～8℃冰箱中短期静置保存。在24、48、72、96 h分别取一个样品，检测细胞密度和细胞活力。本实验用同样的方法重复10次。检测数据分别绘制曲线图并进行统计学分析，得出结论。

2 结果与分析

用1.2项的方法进行了10次实验，分别对每次实验样品的细胞密度和细胞活力进行检测，检测结果如表1所示。

表1 实验样品的细胞密度和细胞活力检测结果

2.1 绘制曲线图 分别绘制细胞密度与细胞活力曲线图(图1、图2)，曲线图显示每个批次的不同时间段样品的检测值变化不大，细胞密度与细胞活力没有随保存时长发生大的变化，趋势线似为平行直线，初步判断在整个培养过程中，细胞密度和细胞活力分别与保存时长呈线性相关。但曲线图并不能说明细胞密度与保存时长或细胞活力与保存时长的线性相关的紧密程度，故采用统计学法进一步论证其线性关系。

图1 细胞密度与保存时长曲线图

2.2 统计学分析 现利用统计学中的线性相关系数法及其公式:和直线回归方程斜率公式:分别以细胞活力和细胞密度为自变量，相应保存时长为依变量求出样本的线性相关系数r和直线斜率b，具体数值见表2、表3数据。在统计学中相关性质判定时，相关系数r值正时为正相关，r值负时为负相关。而且，按r的绝对值大小，定0～0.33为弱相关，0.33～0.66为中等相关，0.66～1为强相关。

图2 细胞活力与保存时长曲线图

表2 细胞活力对保存时长的相关系数与直线斜率数据表

表3 细胞密度对保存时长的相关系数与直线斜率数据表

表2、表3中的样品r值代表了细胞活力(细胞密度)与细胞保存时间这两个变量的相关紧密程度，数据表明这两个变量的相关程度在中等相关以上。而表2、表3中的样品b值是代表两个变量呈线性相关时回归直线的斜率，且样品b值的绝对值全部小于0.1，说明细胞活力(细胞密度)与细胞保存时间这两个变量的回归直线基本为水平直线。

3 讨论与结论

首先对细胞活力的10个实验样本进行直线相关性求解，求得相关系数中除了S101和S106两个样本为弱相关，其余八个样本为线性强相关，也就是说80%的样本为线性强相关，说明细胞在2～8℃条件下保存时，细胞活力与保存时长呈线性规律。从直线斜率上分析，10个样本的直线斜率绝对值全部小于0.06，基本可视为水平直线，说明样品中细胞活力没有随保存时长的增加而发生变化。

其次对细胞密度的10个实验样本进行直线相关性求解，求得相关系数中60%为线性中等相关，40%为线性弱相关，但在60%为线性中等相关的样品中，直线斜率绝对值全部小于0.001，可视为水平直线。又因为在细胞计数中存在点样、计数、稀释等误差，很小的数值误差就会形成大的统计学偏差，所以对细胞密度来说，也可认为在平温保存过程中没有发生降低现象。在生产和实验过程中，一般悬浮细胞的生产周期为48～72 h，而病毒繁殖周期也在10～24 h左右，所以此次研究偏重于生产，只在96 h时间段内进行了试验。

在实验和生产中，细胞的保存与培养起着同等重要的作用。细胞在中长期保存普遍采用-79℃超低温冰柜或-196℃液氮保存。但BHK21悬浮细胞在96 h内短期保存时，经过试验证实，在2～8℃条件下细胞活力和密度不受影响，细胞不会随培养时长的增加而出现活力降低或死亡现象。因此，如果短时间内对BHK21悬浮细胞进行保存时，无论是实验还是生产，无论是便于操作还是利于细胞生存，2～8℃是一个最适的保存温度。

[1]张元兴，易小萍，张 立，等.动物细胞培养工程[M].北京:化学工业出版社，2006:224-225.

[2]范田梅，井莲娜，赵海源，等.冷藏保存BHK21细胞悬液及复苏试验[J].中国兽药杂志，2010，44(3):41-44.

[3]罗燕雯，王玉智，陈兴芳，等.不同温度保存BHK21细胞和IBRS2细胞试验[J].中国兽医杂志，2003，37(12):57-58.