马流感病毒(H3N8亚型，Huabei株)对马的致病性研究

吴 涛，王 嘉，林 健，毛娅卿，韩春华，王 哲，潘 洁，孔冬妮，蒋桃珍*，刘月焕*

(1.中国兽医药品监察所，北京100081;2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京100097)

马流感(ED quine influenza)是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的马、驴、骡等动物的一种急性暴发式呼吸道传染病[1]。自然条件下，只有马属动物易感。病马主要表现发热、咳嗽和流浆液性鼻液，并可通过继发感染其他病原菌而导致病情加重或者死亡，怀孕母马还可发生流产[2-3]。马流感病毒包括2个亚型，分别为H7N7(马1型)和H3N8(马2型)[4]。建国后，我国共有4次马流感大流行，除发生于1974年的第一次流行为H7N7亚型外，至2007年的其他3次大流行均属于H3N8亚型[5]。本文通过临床症状观察、病毒分离及HI抗体检测等指标研究了分离的H3N8亚型马流感病毒(Huabei株)[6]对马的感染情况及致病性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 H3N8亚型马流感病毒(A/Equine/Huabei/1/2007，简称 Huabei株)E2、E3、E4、E5、E10代病毒液由北京市农林科学院畜牧兽医研究所和中国兽医药品监察所分离、鉴定。

1.1.2 实验动物 12匹12月～4岁蒙古马(马流感病毒H3亚型HI抗体阴性)购于内蒙古锡林浩特市正蓝旗浑善达克沙地;2匹8岁骡(马流感病毒H3亚型HI抗体阴性)购于内蒙古化德县;10日龄SPF鸡胚购于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.1.3 主要试剂 受体破坏酶(RDE)由中国疾病预防控制中心病毒病所国家流感中心提供;马流感H3亚型HI抗原与阴、阳性血清由北京市农林科学院畜牧兽医研究所和中国兽医药品监察所制备。

1.2 方法

1.2.1 病毒液的制备 将104倍稀释的E1代病毒经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，孵化60～72 h，收获鸡胚尿囊液。按照同样的稀释倍数和接种方法进行传代，传至E10代。测定E2、E3、E4、E5和E10代马流感病毒(Huabei株)对鸡胚的半数感染量，试验用各代次病毒的鸡胚半数感染量见表1。

表1 试验设计与分组

1.2.2 动物感染实验 12匹蒙古马和2匹骡编号后按照试验时间的先后随机分为5组(试验分组、感染剂量等详细情况见表1)，将各代次病毒原液分别装入喷雾接种瓶中，在试验马的两侧眼睛和鼻孔进行喷雾感染，每匹5 mL。感染后，置负压动物舍，每组实验马隔离饲养。每天定时观察实验马的临床症状，上下午各2次，记录临床症状，同时感染后每天上下午定时测定体温。

1.2.3 病毒分离 分别于感染后3、4、5、6、7 d采集鼻咽拭子，每匹马采集2个棉拭子，一起放于装有1.0 mL TPB(含10000单位青、链霉素)的离心管中，经振荡、离心后，取上清液，经尿囊腔途径接种5枚10日龄SPF鸡胚。孵育观察72 h，测定所有鸡胚HA效价。每份混合拭子样品接种的鸡胚中只要有1枚鸡胚的尿囊液HA效价≥1∶16，即判为病毒分离阳性。

1.2.4 HI抗体检测 感染后14 d，采集所有试验马的血液，分离血清，按照《OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)》[4]中介绍的方法测定病毒感染后马体内的HI抗体，HI效价大于等于1∶20时判为阳性。

2 结果

2.1 体温变化 第1组的4匹马和2匹骡于接种病毒后2 d均出现明显的体温升高，日平均体温最高达42.6℃和41.4℃，且持续期为8 d;第2组的两匹马也于感染后2 d出现明显的体温升高，日平均体温最高达39.8℃，发热持续时间为5 d;第3组的两匹马于感染后2 d均出现体温升高，日平均最高体温为39.0℃，仅持续3 d时间;第4组和5组的4匹马体温正常，平均体温分别为38.0℃和38.2℃，详细结果见图1和表2。

图1 5代Huabei株马流感病毒感染后实验动物的体温变化

2.2 临床症状 第1组(E2代毒)的4匹马和2匹骡接种后2 d均出现精神沉郁，双侧鼻孔流浆液性鼻液和脓性分泌物，1～3号马出现轻度的咳嗽，其中3号马出现呼吸困难，并且持续5 d;第2组的两匹马在感染后3 d出现轻度咳嗽，并持续2 d，双侧鼻孔流出清亮的浆液性鼻液，其中1批马于感染后5 d鼻孔流出脓性分泌物;第3组的2匹试验马于感染后2 d双侧鼻孔均有浆液性鼻液流出，感染后3 d鼻液的量较多，持续2 d，其中1匹马出现呼吸急促;第4组和第5组的4匹马于感染后2 d双侧鼻孔均出现流浆液性鼻液，持续2 d，没有出现发热、咳嗽、呼吸困难，结果见表2。

表2 H3N8亚型马流感病毒感染后马的临床症状和病原学检测结果

2.3 病毒分离 感染后3～6 d，5组12匹马和2匹骡病毒分离都为阳性;感染后7 d，第2组2匹马病毒分离为阴性，其余组马匹病毒分离为阳性。结果见表2。

2.4 马流感病毒 H3亚型HI抗体接种5代H3N8亚型马流感病毒后14 d，5组试验中12匹马和2匹骡的HI抗体效价均明显升高。结果见表2。

3 讨论与结论

为验证马流感病毒Huabei株对其他马属动物的易感性，选择了2匹马流感HI抗体阴性的成年骡用于试验，目前国内尚未见有H3N8亚型马流感病毒感染骡进行试验的相关报道。试验安排在负压动物舍内进行，温度恒定在21.0～23.0℃。在没有冷应激和继发感染存在的前提下，第1组4匹马和2匹骡在E2代病毒接种2 d后出现了持续性发热和流浆液性鼻液的症状，这是马流感典型临床表现，说明马流感病毒Huabei株对马和骡等马属动物同样易感。但成年骡与同组12～18个月龄的试验马匹咳嗽、呼吸困难等临床表现并不一致，这可能与实验用动物的种属、年龄和个体差异(体质和上呼吸道寄生的病原体)有关，还需要进一步试验验证。

试验中将5个不同代次H3N8亚型马流感病毒Huabei株以107.2～107.4EID50的剂量通过喷雾方式经眼和鼻腔途径感染马和骡，14 d后5组试验12匹马和2匹骡血清学反应均为阳性，表明试验用5个代次的H3N8亚型马流感病毒均可以感染马和骡。但不同代次毒感染后出现的临床症状有很大的区别，代次越高临床症状越不明显。国外也有文献报道[7]，马流感病毒人工感染发病模型的建立过程中，可能由于毒株的选择、毒株通过鸡胚的传代次数不同、实验动物、感染途径和感染剂量的不同而导致不同的实验结果。本研究结果证实了马流感病毒Huabei株致病性与鸡胚传代有关，随着鸡胚传代的增加，病毒对马的致病性明显降低，不同代次鸡胚毒致病力改变的分子机制需要进一步研究和探讨。

试验表明，E2、E3代病毒以107.2～107.4EID50剂量经喷雾途径感染可使12～18个月龄的马匹出现持续性发热和流鼻液的典型马流感症状。本研究成功建立了马流感病毒Huabei株的感染发病模型，确定了感染剂量及代次，为马流感疫苗效果评价奠定了试验基础。

[1]Wilson W D.Equine influenza[J].Vet Clin North Am Equine Pract，1993，9(2):257-282.

[2]Sovinova O，Tumova B，Pouska F，et al.Isolation of a virus causing respiratory disease in horses[J].ActaVirol，1958，2:52-61.

[3]Wadell H，Teigland B，Sigel M.A new influenza virus associated with equine respiratory disease[J].J Am Vet Assoc，1963，143:587-590.

[4]世界动物卫生组织.OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)[M].农业部兽医局/中国动物卫生与流行病学中心译.北京.2007:622-626.

[5]郭 巍，闫 妍，王英原，等.新疆地区一株马流感病毒的分离及鉴定[J]. 中国预防兽医学报，2008，30(8):586-591.

[6]蒋桃珍，刘月焕，林 健，等.2007年华北地区H3N8亚型马流感病毒的分离与鉴定[J].中国兽医学报，2010，30(5):607-611.

[7]Jennifer A，Mumford D，Hannant，et a1.Experimental infection of ponies with equine influenza(H3N8)viruses by intranasal inoculations or exposure to aerosols[J].Equine Vet J，1990，22(2):93-98.