恩诺沙星注射液中非法添加磺胺嘧啶HPLC-PDA检查法的建立

郭桂芳，杨 星，董玲玲，徐 嫄，郝利华

(中国兽医药品监察所，北京100081)

目前政府对兽药市场制假、造假打击力度日渐加深，而非法添加现象仍时有发生。笔者在对某企业某批次恩诺沙星注射液进行监督抽检时发现，除主成分外还发现处方外成分。随即对该未知成分用HPLC-PDA法对其色谱行为和光谱行为进行进一步研究探讨，通过与对照品保留时间及光谱图的匹配度的比对，确证其中未知物为磺胺嘧啶，为处方外非法添加物，对此建立相应的检查方法[1-3]。本方法的建立为监管部门执法提供了技术依据，并为非法添加检查方法的建立提供参考和借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪 器 高效液相色谱仪Waters 2695，二极管阵列检测器2998(PDA)，美国waters公司;精密天平AE240，精度0.01 mg，梅特勒精密仪器厂。

1.2 受试药物 磺胺嘧啶对照品、磺胺对甲氧嘧啶对照品、磺胺间甲氧嘧啶对照品、磺胺喹噁啉对照品、磺胺氯达嗪钠对照品，均来自中国兽医药品监察所。恩诺沙星注射液:某市售产品，规格10 mL:0.5 g。

2 方法与结果

2.1 鉴别检查 采用《中华人民共和国兽药典》2010年版一部[4]恩诺沙星注射液质量标准中鉴别(2)方法，色谱条件为:采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.025 mol/L磷酸溶液(以三乙胺调节pH值至3.0)，检测波长278 nm。

结果见图1、图2。受试样品色谱图中检出两色谱峰，10.7min处与对照品色谱峰一致，为主成分恩诺沙星，4.763 min处峰为未知峰。

图1 受试样品色谱图

图2 恩诺沙星对照品色谱图

2.2 HPLC-PDA筛查

2.2.1 HPLC-PDA色谱结果 将2.1项中将紫外检测器改为PDA检测器。对受试样品按2.1项条件测定。结果见图3。色谱图中9.124 min处为恩诺沙星峰，其最大吸收波长为278 nm，7.111 min处为未知峰，最大吸收波长为267 nm。对未知峰进行峰纯度分析，见图4，纯度小于阈值。故未知峰为单一成分。其最大吸收波长与光谱图特征与磺胺类药物类似。

2.2.2 对照品对比试验 分别取各磺胺对照品适量，加0.1 mol/L氢氧化钠试液10 mL使溶解，加流动相稀释至约0.1 mg/mL，按上述色谱条件，测定受试样品中未知峰与各对照品色谱图主峰保留时间是否一致，光谱图是否匹配。结果见图5、图6。磺胺嘧啶对照品主峰保留时间与供试样品未知峰保留时间一致;两色谱峰最大吸收波长及光谱指数图相匹配。

2.3 方法学考察及优化

2.3.1 耐用性 流动相比例改变:色谱柱采用Alltima C18 柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)，在药典[4]规定范围调节流动相比例。色谱分离表明，水相与有机相之比为78∶22时，两峰分离度小于1.5，当比例为88∶12时，恩诺沙星峰保留时间超过30 min，故选择流动相比例为83∶17。不同型号色谱柱的影响:采用不同型号C18柱，其他条件不变时，测定结果见表1。

图3 供试样品光谱图与色谱图

图4 未知峰纯度图

图5 磺胺嘧啶对照品和受试样品色谱图

图6 磺胺嘧啶对照品和供试样品7．1 min色谱峰匹配图

表1 不同型号色谱柱对方法系统适用性的影响

上述三种型号色谱柱均能使恩诺沙星峰与磺胺嘧啶峰分开。

2.3.2 线性 取磺胺嘧啶对照品50 mg，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L的氢氧化钠溶液使溶解，加流动相稀释至刻度摇匀，精密量取 1、3、5、7、9 mL 于50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，测定。按磺胺嘧啶峰面积与对应的浓度作标准曲线，并计算回归方程和相关系数。

磺胺嘧啶回归方程为y=873577x+98154，R2=1。表明磺胺嘧啶在20～180 μg/mL浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.3.3 检测限与定量限 恩诺沙星储备液:取恩诺沙星对照品25 mg，用流动相稀释制成每1 mL含0.5 mg/mL的溶液，备用。

检测限溶液制备:取磺胺嘧啶对照品适量，加恩诺沙星储备液1 mL于10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，测定。光谱指数图失真前的浓度为本法的检测限，S/N≥10的浓度为定量限。该色谱条件下磺胺嘧啶检测限为 5 μg/mL，定量限为10 μg/mL。

2.3.4 准确度 以磺胺嘧啶钠注射液10 mL:1 g规格为100%，分别以80%、100%、120%进行三个浓度各三平行添加回收，其中含恩诺沙星的量不变。回收率结果见表2。

表2 磺胺嘧啶回收率结果

2.4 样品测定结果 用上述建立的HPLC-PDA法对该批恩诺沙星注射液进行了磺胺嘧啶的含量测定，六份平行样测定结果见表3。

表3 恩诺沙星注射液中磺胺嘧啶含量测定结果(mg/mL)

3 讨论

目前对于兽药非法添加仍然采取检出何种添加物建立该成分的检测方法，并以补充标准予以发布，结果可能会出现该成分在不同产品中添加而建立一系列的补充标准，并进行一系列的方法学研究资料，造成大量重复性工作。笔者认为建立一个比较完整的常见兽药数据库显得更加尤为重要，发现问题产品时，通过直接与数据库比对其光谱行为和色谱行为，来判断处方外成分，即可大大缩短方法建立时间，可快速为兽药监管部门执法提供有力的技术保障。而本文中所进行的定性、定量研究手段可作为数据库建立时方法建立的借鉴。

[1]郝利华，于晓辉，董玲玲，等.HPLC-PDA法同时测定黄芪多糖注射液中非法添加的四种解热镇痛类药物[J].中国兽药杂志，2012，46(8)，28-31.

[2]郝利华，毕言锋，郭桂芳，等.HPLC-PDA法测定黄芪多糖注射液中非法添加利巴韦林的试验[J].中国兽医杂志，2013，49(2)，76-78.

[3]吴小红，李焕德.高效液相色谱法-二极管阵列检测器同时分析测定中成药及保健品中非法添加的9种糖皮质激素[J].中南药学，2009，7(5):324-327.

[4]中华人民共和国兽药典委员会.中华人民共和国药典二○一○年版一部[S].