蛋白TLR4在人胰腺癌组织中的表达及其病理特征相关分析

黄 喆 郭克建 何三光 刘 放 林 杰

Toll样受体家族(toll like receptors，TLRs)是 1 种跨膜受体，它主要决定果蝇的腹背侧体轴发展的方向性及非特异性的免疫反应。Medzhitov等［1］于1997年在人类第一次发现于果蝇Toll蛋白相类似的人类TLR，即TLR4。目前已知的TLR家族成员共11个［2］。TLR家族广泛表达与哺乳动物的细胞表面，是主要感受病原体入侵的受体，也是天然的免疫分子，其不仅能表达在免疫细胞当中，也能表达在多种肿瘤细胞当中［3］。肿瘤细胞中TLRs激活不但能增加细胞的凋亡及增殖抵抗，还能够促进肿瘤细胞的免疫逃避、浸润及转移［4］。然后，TLR4表达与胰腺癌细胞的浸润、转移等相关性目前仍不甚清楚，本组研究对胰腺癌患者中的TLR4表达情况进行研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择我院2008年1月至2010年1月收治的胰腺癌患者共66例，所有患者的临床病理资料均完整。所有患者均给予手术治疗，术前未行放疗或化疗，术后经病理检查证实。男性43例，女性23例。年龄33～75岁，平均(57.8±7.6)岁。胰头癌40例，胰体尾癌26例。其中低分化腺癌31例，中分化腺癌23例，高分化腺癌12例。患者伴有淋巴结转移者41例，无淋巴结转移25例。肿瘤直径＞3 cm者38例，≤3 cm者28例。按2002年国际抗癌协会(UICC)制定的TNM临床分期标准分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期21例，Ⅲ期31例，Ⅳ期5例。此外，收集36例癌旁距肿瘤5 cm内、36例癌旁距肿瘤5 cm以上的正常胰腺组织标本作为对照组。

1.2 免疫组织化学检测

采用免疫组织化学染色超敏两步法(SP染色法)对不同胰腺组织中的TLR4蛋白表达进行检测，兔抗人TLR4多克隆抗体为Sigma公司产品，免疫组化SP试剂盒以及DAB显色剂为武汉博士德生物科技有限公司产品。具体操作严格按照SP免疫组化试剂盒的说明书进行。采用PBS替代一抗为阴性对照，其中TLR4蛋白阳性染色分布于细胞质和细胞膜中，显示为棕黄色。随机观察5个不同的高倍视野，根据阳性细胞率以及阳性染色的强度判断染色结果［5］。其中阳性细胞率≥50%为3分，30%～49%为2分，6%～29%为1分，≤5%为0分。细胞染色棕褐色计3分，棕黄色计2分，淡黄色计1分，无染色计0分。其中5分及以上为强阳性(+++)，3～4分为中等强度阳性(++)，2分为弱阳性(+)，0～1分为阴性(-)。

1.3 评价指标

评估分析TLR4表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯、组织学分级、TNM分期等相关性，随访2年，分析TLR4表达与胰腺癌患者生存时间的相关性。

1.4 统计学处理

应用SPSS 16.0统计学软件处理，数据采用均数±标准差表示，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05有显著统计学差异。

2 结果

2.1 不同胰腺组织中TLR4蛋白表达情况

胰腺癌组织组TLR4蛋白表达阳性率为71.2%，显著高于癌旁组织组的(38.9%)和正常组织组的(0)，结果对比有显著统计学差异(P＜0.05)，见表1。

表1 不同胰腺组织中TLR4蛋白表达情况/例

2.2 TLR4表达与胰腺癌临床病理特征的相关性

TLR4表达与肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯及TNM分期与存在明显相关性，P＜0.05，见表2。

2.3 胰腺癌组织中TLR4表达与患者生存时间的相关性

TLR4表达阳性组平均生存时间(12.6个月)显著短于阴性组(19.5个月)，有统计学意义(P＜0.05)。

表2 TLR4表达与胰腺癌临床病理特征的相关性/例

3 讨论

Toll样受体家族(toll like receptors，TLRs)是1种跨膜受体，它主要决定果蝇的腹背侧体轴发展的方向性及非特异性的免疫反应。TLR4是Toll样受体家族的成员，是重要的免疫分子，能够对损伤分子模式及病原相关分子模式进行识别。TLR家族广泛表达与哺乳动物的细胞表面，是主要感受病原体入侵的受体，也是天然免疫分子，不仅能表达在免疫细胞中，也表达在多种肿瘤细胞中。TLR4主要在淋巴细胞、自然杀伤细胞以及巨噬细胞树突状细胞等免疫细胞中表达，在机体的天然免疫过程中发挥巨大的作用［6-8］。此外，近年来研究发现TLR4在多种恶性肿瘤组织及肿瘤细胞系中呈高表达，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、头颈鳞状细胞癌、结直肠癌、黑色素瘤、肺癌、喉癌、前列腺癌、胆囊癌及胰腺癌［9-11］。金海敏等［12］采用 PCR法对大肠癌及癌旁组织中的TLR4表达情况进行检测，发现TLR4在大肠癌组织中表达显著高于癌旁组织的表达。而且TLR4在大肠癌中的表达与VEGF、TGF-β的表达密切相关。Yang等［13］报道在人乳腺癌细胞系中，TLR1-TLR10均有不同程度的表达，其中TLR4表达为最高。Zhang等［14］研究发现，TLR4在人胰腺癌组织中呈高表达(69.2%)，显著高于对照组(39.5%)，表明TLR4 蛋白在胰腺癌组织中呈现高表达。这些研究表明TLR4表达与恶性肿瘤的发生发展密切相关。本研究对不同胰腺组织中TLR4蛋白表达对比分析，胰腺癌组织组TLR4蛋白表达阳性率为71.2%，显著高于癌旁组织组(38.9%)和正常组织组(0)，有显著差异(P＜0.05)。本研究结果表明胰腺癌组织中存在TLR4蛋白高表达，与胰腺癌存在着相关性。

关于TLR4促进肿瘤侵袭和转移的分子机制，TLR4与胰腺癌组织病理相关性等目前均未完全阐明。本研究显示在TLR4蛋白表达与临床病理特征的相关性分析中，肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯及TNM分期与TLR4高表达存在相关性(P＜0.05)。本研究结果进一步显示，在肿瘤大小(D＞2.0 cm)、淋巴结转移阳性(+)、血管侵犯阳性(+)以及高TNM分期胰腺癌组织中，TLR4蛋白表达显著升高，此次研究结果与Zhang等［14］研究结论一致。因此，TLR4蛋白在癌组织高表达与胰腺癌转移、侵袭及恶性程度均密切相关，其在肿瘤细胞侵袭、转移过程中均起到了重要作用。此外，本研究对胰腺癌组织中TLR4表达与生存时间相关性分析显示，TLR4蛋白表达阳性组平均生存时间显著低于阴性组(P＜0.05)。研究结果表明，TLR4高表达与胰腺癌患者的生存期呈负相关，故可作为判断胰腺癌患者的预后指标之一。

综上所述，本研究显示TLR4蛋白在胰腺癌组织中存在高表达与胰腺癌的转移、侵袭以及恶性程度均密切相关，而且能够促进胰腺癌进展。由于胰腺癌侵袭和转移涉及到多个方面因素，胰腺癌组织的TLR4蛋白阳性高表达在胰腺癌发生、发展机制中还有待进一步深入研究。

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