利用氢化物发生-冷阱捕集-原子吸收光谱联用技术测定雄黄染毒大鼠血中砷的含量

张颖花，高 咏，霍韬光，姜 泓*，孙贵范,3

(1.中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110001； 2. 沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110013； 3.辽宁省砷生物学作用与砷中毒重点实验室，辽宁 沈阳 110001)

雄黄是含砷的常用中药，临床应用广泛，同时也是国务院在《医疗用药毒性药品管理办法》中特别规定的28种毒性中药之一. 由于砷是已知毒物，近年，随着人们用药安全意识的提高，有关雄黄用药安全性问题受到了国内外医学界的质疑，影响了含雄黄中成药的国际声誉，由此引发的雄黄对人体健康的影响，已成为人们关注的焦点.

无机砷(iAs)在体内的代谢研究表明[1-2]，iAs在体内经过氧化、甲基化和还原过程，生成一甲基胂酸(MMA)和二甲基胂酸(DMA). 关于雄黄染毒后体内各组织、器官内总砷含量的研究报道较多[3-4]，主要采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)和原子荧光法(AFS)等. 而雄黄在体内代谢后的砷形态的研究报道较少，作者采用氢化物发生-冷阱捕集-原子吸收法(HG-CT-AAS)检测雄黄染毒后大鼠血液中砷的形态和含量，为进一步研究雄黄进入人体后的作用特点和安全性提供依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

氢化物发生-冷阱捕集-原子吸收分光光度计(日本岛津公司)；pH-3c型酸度计(上海精密科学实业有限公司)；XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；Easypure纯水系统(美国Barnstead公司).

雄黄(成大方圆药店)，对照品iAs、MMA、DMA(Yamanashi公司，日本)的浓度均为1 000μg/L，硫酸为优级纯，其他试剂均为分析纯.

清洁级健康4周龄Wistar大鼠32只(中国医科大学实验动物部提供)，体重50 ± 10 g，雌雄各半.

1.2 实验动物分组及染毒

按体重随机分成4组，每组8只. 以0.5% CMC-Na水溶液为混悬介质，实验组灌胃给予雄黄的剂量分别为0.3、0.9和2.7 g/kg，对照组给以0.5% CMC-Na水溶液，连续灌胃6周，每日1次. 在动物灌胃期间每3天称重1次，调节灌胃剂量. 动物实验室温度(24 ± 1)℃，相对湿度(50 ± 5)%，每天12 h光照，动物可自由摄食摄水.

1.3 样品采集及处理

于末次给药2 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血. 准确吸取血液0.1 mL，用1.0 mL超纯水混悬，加入1.0 mol/L的H2SO42 mL，超声10 min，作为供试品溶液，备用.

1.4 含量的测定

将1.3项下制备的溶液分别稀释至浓度在1～60 μg/L范围内，注入HG-CT-AAS中，检测iAs、MMA和DMA. 进样体积为0.5 mL，检测波长为193.3 nm.

1.5 统计学分析

所得数据以平均值±标准差表示，用SPSS16.0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行各指标组间差异的显著性检验，以P<0.05作为检验的显著性差异.

2 结果与讨论

2.1 线性关系考察

以对照品溶液的浓度为横坐标，其峰面积值为纵坐标进行直线回归，得线性回归方程见表1，结果表明iAs、MMA和DMA在一定浓度范围内线性关系良好.

表1 形态砷的标准曲线Table 1 Analysis of calibration standards of arsenic species

2.2 回收率、精密度及检出限考察

实验证明，建立的形态砷分析系统灵敏度高、准确性好、回收率高. iAs、MMA和DMA的回收率分别为95.1%、97.1%和101.6%；精密度分别为2.3%、3.6%和1.9%；iAs、MMA和DMA的检出限均为1.0 ng.

2.3 血中形态砷的测定

结果表明，雄黄在体内的代谢产物为iAs、MMA和DMA，其中DMA为主要代谢产物，并且随雄黄染毒剂量的增加各形态砷水平逐渐升高. (见图1，表2)

表2 血中形态砷含量Table 2 Result of arsenic species in blood

注：-表示未检测到；*表示与对照组比，P<0.05

A．对照品图，B．供试品图. 1：iAs (tR=0.576 min)，2：MMA (tR=1.037 min)，3：DMA (tR=1.757 min)图1 As、MMA和DMA的HG-CT-AAS图Fig.1 HG-CT-AAS chromatograms of iAs、MMA and DMA

2.4 氢化物发生-冷阱捕集的原理

硼氢化钠在酸性溶液(盐酸)中产生新生态氢，将样品中的砷还原成砷化氢气体. 其中AsⅢ和AsⅤ生成AsH3，MMA生成CH3AsH2, DMA生成(CH3)2AsH. 所生成的砷化氢在载气(氦气)的带动下进入浸在液氮中的U型玻璃管(内填充物为硅藻土)，被低温捕集，U型玻璃管受热后，根据气体沸点(AsH3为-55 ℃，CH3AsH2为2 ℃，(CH3)2AsH为36.5 ℃)不同依次进行分离释放出来，而其他样品基质不发生反应被留在废液中.

2.5 讨论

随着检测技术的发展，研究者们证实了iAs经甲基化产生的不同形态砷，又分为不同价态，将人们对砷代谢的认识引入更深的层面. 近年的研究显示，砷在机体中生物转化所产生的不同形态、价态砷化物具有不同的毒性和靶器官，其中，三价有机砷化物[MMA(III)和DMA(III)]，尤其是MMA(III)毒性最强. 体外实验显示，几种砷甲基化产物的细胞毒性依次为：MMA(III)≥DMA(III)>iAs(III)>iAs(V)>MMA(V)=DMA(V)[5]. 因此，研究雄黄中砷的毒性时，仅从体内总砷的含量不能充分的表明雄黄对机体的毒/药效作用机制，必须从形态和价态的角度研究其中间代谢产物在体内存留的形式和时间. 但我们在现有的检测条件下不能对三价和五价砷化合物进行区分，只测定iAs(III+V)、MMA(III+V)、DMA(III+V).

3 结论

雄黄在体内的代谢产物为iAs、MMA和DMA，其中DMA是主要代谢产物；HG-CT-AAS法测定血中形态砷的含量精密度、准确度及回收率较高，线性关系良好.

参考文献：

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