乳酸菌利用低聚果糖代谢机理的研究进展*

陈臣，周方方，任婧，艾连中，陈卫

1(江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)2(光明乳业股份有限公司研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海，200436)

低聚果糖(fructooligosaccharides，FOS)又名寡果糖或蔗果三糖族，是指以2～10个果糖基为链节，以1个葡萄糖基为链的端基，以果糖基→果糖连接键(β(2－1)键或β(2－6)键)为主体骨架连结形成的碳水化合物。根据生产工艺的不同，低聚果糖分为两种:一种是由蔗糖通过β-果糖苷酶的转糖基作用来生产的，包括蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的混合物，简称为GFn类型的低聚果糖;另一种是菊粉通过内切菊粉酶部分水解得到，聚合度范围在2～10，简称为FFn类型的低聚果糖［1］。

低聚果糖除具有一般功能性低聚糖的物理化学性质外，最引人注目的生理特性是它能明显改善肠道内微生物种群比例。由于低聚果糖特殊的糖苷键组成，不能够被消化道的胃酸和酶消化，而直达大肠，被双歧杆菌、乳杆菌等选择性的利用，使其迅速增殖;此外低聚果糖经代谢后产生的短链脂肪酸，可以使肠道内pH值趋向酸性，抑制外源性致病菌和肠道内固有真菌等的生长繁殖。另外，低聚果糖作为一种天然存在的的水溶性膳食纤维，还有降低血清胆固醇，促进钙质吸收等功能。因而低聚果糖做为一种最为常用的益生元已被广泛的应用于食品工业中。

尽管低聚果糖对双歧杆菌和乳杆菌的选择性增殖作用早已被大量体内和体外研究证实，但是乳酸菌的代谢低聚果糖的分子机理则是近年来刚开始展开研究的。前期研究发现不同菌株代谢低聚果糖的途径不同，存在明显的菌株特异性。因而研究乳酸菌代谢低聚果糖的途径和代谢过程中产物的变化对于进一步了解乳酸菌的代谢状况，选择合适的益生元、益生菌组合均具有重要的借鉴意义。本文在描述乳酸菌代谢低聚果糖的基本途径之上，分别对目前双歧杆菌、乳杆菌及其他乳酸菌利用低聚果糖的研究进展进行综述。

1 乳酸菌代谢低聚果糖的基本途径

乳酸菌代谢低聚果糖基本都是通过两种方式进行的(图1)，一是低聚果糖完整的转运进胞内后再由胞内的果糖苷酶进行水解;另一种是先由胞外的酶对低聚果糖进行水解，再将水解产物运输入胞内。负责转运低聚果糖的转运蛋白主要包括3种:①ABC转运系统，是一组跨膜蛋白，具有ATP结合区域的单向底物转运泵，以主动转运方式完成多种分子的跨膜转运，该系统主要在嗜酸乳杆菌和弯曲乳杆菌中发现;②PTS转运系统，属于基团移位的一种，磷酸烯醇丙酮酸(PEP)将磷酰基转移至其糖类底物同时伴有PTS糖类易位穿过细菌膜转移至胞内，该系统在杆菌、乳球菌中比较常见。③透性酶系统，属于主动运输的一种，透性酶在胞膜外与底物高亲和力牢固结合，在能量供给的条件下，逆浓度差将物质转运到菌体内，该系统主要在双歧杆菌中发现。

负责水解低聚果糖的酶有多个(表1)，包括:果糖苷酶(EC 3.2.1.26)，菊粉酶(EC3.2.1.7)，果聚糖酶(EC 3.2.1.65)，果聚糖β-果糖苷酶(EC 3.2.1.80)，2，6-β-果聚糖6-果聚糖水解酶(EC 3.2.1.64)等。尽管这些酶命名和酶分类有所差异，但是他们都是属于糖苷水解酶32家族和68家族。这些酶一个共同点是结构中均含有保守域NDPNG、FRDP 和 ECP，催化中心含有 Asp，Glu、Cys等［2］。然而，乳酸菌对糖类的代谢与其生存环境息息相关，因而存在多种类型的转运系统和水解酶系，使得不同种的乳酸菌，甚至同种不同株细菌之间也存在着差异。

图1 乳酸菌代谢低聚果糖的基本途径Fig.1 The basic pathways for fructooligosaccharides metabolism in lactic acid bacteria

2 双歧杆菌代谢低聚果糖的研究进展

大部分双歧杆菌都可以高效的利用低聚果糖，因而低聚果糖做为一种最常用的双歧因子，被广泛的应用于增殖双歧杆菌。双歧杆菌主要是通过透性酶系统对低聚果糖进行运输，后再通过胞内的β-呋喃果糖苷酶进行水解［12］。

表1 低聚果糖水解相关酶系Table 1 β-fructosidases involved in hydrolysis of fructooligosaccharides

双歧杆菌的果糖苷酶性质最早是在B.adolescentis G1［13］中发现的，后来陆续报道了6种来自双歧杆菌的果糖苷酶。通过比较发现，双歧杆菌的果糖苷酶分子质量大小存在显著差异，大部分报道的在59.4～74.0 kDa之间，然而对 B.infantis JCM no.7007的研究发现［14］，该菌负责水解蔗果三糖和蔗果四糖的果糖苷酶分子质量为232 kDa，由3个75 kDa亚基组成。双歧杆菌的果糖苷酶最适宜生长温度一般为37℃，最适pH为5.5～6.5，活性普遍受到Cu2+，Ag+，Hg2+的显著影响，表明含有巯基的氨基酸基团对于果糖苷酶的活性非常重要。双歧杆菌的果糖苷酶的一个显著特点是对低聚果糖的亲和力显著强于蔗糖，这与非肠道细菌来源的果糖苷酶正好相反;此外这些果糖苷酶大部分均不具有转糖基的活性，除了对B.adolescentis G1的研究发现，当使用GF2做为底物时，该酶还具有很低的转糖基活性［13］。

双歧杆菌的果糖苷酶主要作用于果聚糖中非还原末端的β(2-1)糖苷键，包括低聚果糖、蔗糖、菊粉、棉子糖等，然而对B.breve UCC2003的果糖苷酶研究发现，该酶特异性地水解低聚果糖中葡萄糖和果糖之间的β(2-1)糖苷键而对果糖基之间的糖苷键没有活性，即以葡萄糖为最终产物，这种特性是在双歧杆菌中第一次被发现的［15］。除了对含有β(2-1)糖苷键的低聚糖具有水解能力外，少数双歧杆菌的果糖苷酶还具有水解细菌果聚糖(levan)的能力，表明这些酶还可以水解β(2-6)糖苷键，但报道的活性都比较低［3，16］。

双歧杆菌果糖苷酶的三维晶体结构于2011年被首次解析［17］，研究发现来自B.longum KN29.1的果糖苷酶具有典型的糖苷水解酶32家族蛋白的结构组成:一个N-端β-螺旋桨结构域和一个C-端的β-三明治结构域。活性中心位于β-螺旋桨结构域中，含有Asp-23和Glu-204分别作为亲核供体和酸碱催化剂。与其他报道的糖苷水解酶32族成员相比，在该酶的结构中发现一个独有的N-端α-螺旋，推测与双歧杆菌定殖于人体肠道中有关。双歧杆菌果糖苷酶结构的解析有助于我们增加对双歧杆菌代谢低聚果糖机理的理解，同时也为我们通过基因工程手段改善果糖苷酶的活性打下了基础。

除了对果糖苷酶的研究外，在双歧杆菌利用低聚果糖的生长中发现，其代谢低聚果糖存在有显著的代谢阻遏效应。在早期的对3株双歧杆菌B.adolescentis ATCC 15703，B.longum ATCC 15707 和B.thermophilum ATCC 25525 研 究 中［18］，发 现 除B.longum ATCC 15707外，另外2株菌的果糖苷酶活性均被葡萄糖和果糖抑制，表明这些糖对果糖苷酶的表达存在代谢阻遏效应。B.thermophilum ATCC 25525合成果糖苷酶需要菊粉的诱导，表明该菌的代谢调控是通过诱导/抑制模式进行的;而B.adolescentis ATCC 15703是持续合成果糖苷酶的，表明该菌的通过抑制/去抑制模式进行调控的。对B.infantis strain ATCC 15697在混合碳源培养的研究中发现［19］，葡萄糖的存在会抑制其果糖苷酶的活力，菌株只会利用葡萄糖而对蔗糖或低聚果糖均不利用。而在以果糖为碳源的培养基驯化至少5代后，低聚果糖会和葡萄糖同时被利用，表明果糖会诱导相应的果糖苷酶。对 B.breve UCC2003［15］的研究发现，其fos操纵子在蔗糖、低聚果糖为碳源的培养基生长中被激活而被果糖和葡萄糖抑制。根据同源性的比较和分析，推测该操纵子受到和它临近的调控蛋白LacIfos和葡萄糖激酶GlkA的调控，其具体的调控机理尚待研究。

3 乳杆菌代谢低聚果糖的研究进展

研究发现，并不是所有乳杆菌都能利用低聚果糖，大部分的 L.acidophilus，L.plantarum和 L.casei都能利用低聚果糖，而被广泛研究的益生菌株LGG却不能利用低聚果糖，此外常用于生产酸奶的L.delbrueckii subsp.bulgaricus也不能利用低聚果糖［20］。这纠正了曾被广泛认可的低聚果糖可以增殖所有的乳酸菌的误区，从而帮助我们更加科学地选择合适的益生元和益生菌的组合以达到最大的效果。

随着的发展，表达谱芯片技术被广泛应用于研究细菌在不同环境应激下基因表达的差异，而乳杆菌代谢低聚果糖的途径最早是也是通过该方法研究L.acidophilus NCFM［21］提出的。研究发现一个大小为9 Kb的基因簇负责L.acidophilus NCFM低聚果糖的转运和分解。该基因簇由7个基因组成，包括一个LacI家族转录调节因子，MsmR;4个基因组成的ABC转运系统，MsmEFGK，负责低聚果糖从胞外到胞内的运输;一个果糖苷酶BfrA，负责胞内水解低聚果糖;和一个蔗糖磷酸酶GtfA。Goh［22］等人采用类似的的手段研究了L.paracasei 1195对低聚果糖代谢的途径，比较了该菌在葡萄糖和低聚果糖分别做为唯一碳源下生长的差异。实验发现1个大小为12 Kb的操纵子，由转录调节因子(fosR)，4组分果糖/甘露糖特异PTS转运系统(fosABCD)，1个假设蛋白(fosX)和1个β-果糖苷酶(fosE)基因组成。对 L.plantarum WCFS1的研究则发现其代谢低聚果糖的途径与其代谢蔗糖的途径相类似，由5个基因组成的基因簇来参与，包括1个果糖激酶(SacK1)，1个PTS转运系统(PTS)，1个 β-果糖苷酶(SacA)、1 个转录调节蛋白(SacR)及1个α-葡萄糖苷酶(Agl2)组成。这些乳杆菌利用低聚果糖的基因都是通过1个基因簇来控制的，其主要包括转运系统，水解酶系及相应调控蛋白组成。但是其作用方式却不尽相同。对于L.plantarum WCFS1和L.acidophilus NCFM来说，它们是通过先转运再水解的方式进行的，由于转运蛋白能力的限制，使得他们对低聚合度的低聚果糖有更好的利用能力，而不能利用高聚合度的低聚果糖;对于L.paracasei 1195来说，它是通过先水解再转运的方式进行的，这就决定了他们对不同聚合度的低聚果糖都可以利用。然而由于L.paracasei 1195是在胞外进行低聚果糖水解的，使得部分水解生成的单糖也可以被周围的其他共栖菌群所利用，对其选择性增殖并不有利。

低聚果糖代谢相关的基因簇在蔗糖或者低聚果糖存在条件下是共转录的，但是葡萄糖抑制他们的转录和表达。对于代谢调控的研究发现，这些基因簇一方面受到底物诱导的转录调控因子的调控，例如葡萄糖的存在会使低聚果糖相关基因簇转录调控因子磷酸化程度不够，从而造成相应的转录受到抑制;另一方面葡萄糖通过PTS转运，会造成大量果糖1，6-二磷酸的产生，它会使HPr蛋白磷酸化，而磷酸化的HPr蛋白做为辅助阻遏物和代谢控制蛋白A(CcpA)一起与位于转录起点的代谢反应元件(cre)结合来抑制该操纵子的转录［23］。

通过基因结构和序列比较，发现乳杆菌利用低聚果糖的能力并不是与生俱来的。NCFM的低聚果糖代谢基因簇与Streptococcus mutans的msm操纵子和Streptococcus pneumoniae的raf操纵子有很大的相似性。而对L.plantarum WCFS1的研究发现，该菌的果糖苷酶和PTS转运系统与其他乳杆菌相比差异很大，但是却与Pediococcus spp.相关基因有很高的相似性。这些结果表明这些他们在环境中可能通过水平转移方式从共栖的微生物中获得利用低聚果糖的能力。

对乳杆菌的果糖苷酶报道相对较少，Muller［10］于2002年从L.pentosus B235发酵上清中分离得到胞外的果聚糖-β果糖苷酶(EC 3.2.1.80)，该酶分子质量为126 kDa，对β(2-6)果糖苷键活力最强，也可以水解β(2-1)果糖苷键。该酶可由蔗糖、大蒜低聚糖和菊粉等诱导，但是受到葡萄糖抑制。对乳杆菌L.paracasei 1195的研究发现，该菌果糖苷酶N端包含信号肽，在C端包括细胞壁锚定位点LPQAG，表明该酶是位于细胞壁表面的胞外酶。在大肠杆菌克隆表达该酶的核心区域，发现该酶对细菌果聚糖中的β(2-6)果糖苷键活力最强，随后是低聚果糖、菊粉，对蔗糖的水解能力最弱，该酶的广泛的底物特性预测与其催化中心中含有特殊的氨基酸集团Ser-472、Gln-475、Tyr-476 有关［24］。

4 对其他乳酸菌的研究

关于其他类乳酸菌代谢低聚果糖的研究较少，主要集中在链球菌属。在早期研究乳酸菌和双歧杆菌的实验中，四株S.thermophilus均不能使添加了的溴甲酚紫的以低聚果糖为碳源的培养平板变色［20］，而采用同样的方法则发现S.thermophilus NCIM 2904能在低聚果糖为碳源的培养基上生长［25］。Hartemink［26］等发现链球菌属的部分菌株 S.mutans、S.gordinii和S.mitis能利用低聚果糖，其中S.mutans和S.gordonii能降解所有的低聚果糖，而S.mitis主要水解的是Fn类型的低聚果糖。这些结果表明链球菌属代谢低聚果糖也具有明显的菌株特异性。

5 展望

低聚果糖作为一种典型的益生元，在调节肠道菌群方面的卓越功效已经得到公认。然而由于肠道菌群组成数量多且十分复杂，非益生菌群如拟杆菌等也具有利用低聚果糖的能力，因而选择特定的具有选择性增殖益生菌能力益生元就十分重要。同时不同乳酸菌代谢低聚果糖都有其菌种特异性，因而需要探索不同乳酸菌利用低聚果糖的途径，选择最合适的乳酸菌/低聚果糖组合以达到更大的益生效应。此外，现有研究发现乳酸菌代谢低聚果糖存在着多种调控机制，如何合理利用调控机制促进低聚果糖更好地被乳酸菌利用也是未来研究的重点。随着新技术手段的发展，特别是基因组学、转录组学和蛋白组学的应用，将为研究益生乳酸菌与益生元的相互作用提供更好的平台，促进益生菌和益生元在肠道内发挥更大的作用，为人类造福。

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