塞来昔布通过ERK1／2信号通路对肝癌细胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影响

西安交通大学医学院第一附属医院（西安710061） 李 琛 于 良

肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，其起病隐匿，病死率高，预后极差。肝癌在全球发病率呈逐步上升趋势，但目前临床尚无有效治疗药物。研究表明［1］，长期服用非甾体类抗炎药物可降低消化道恶性肿瘤的发生率。本研究观察塞来昔布对肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡及COX-2、VEGF和ERK1／2表达的影响，并探讨该作用与ERK1／2信号通路之间的关系，为其用于肝癌的治疗提供理论依据。

材料与方法

1 试剂和仪器 主要试剂：人肝癌细胞株SMMC-7721购自第四军医大学细胞所；塞来昔布购自美国希尔大药厂；新生胎牛血清购自杭州四季青公司；二甲基亚砜（DMSO）、四氮噻唑盐（MTT）、胰蛋白酶、琼脂糖均购自美国Sigma公司；双抗购自山东鲁抗制药公司；兔抗人COX-2、ERK1／2多克隆抗体、羊抗人VEGF多克隆抗体购自SantaCruz公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司；SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒TaKa-Ra公司；PCR引物由上海生工公司合成。主要仪器：实时荧光定量PCR扩增仪购自美国 MJ公司；YCP-200CO2培养箱购自上海易亮医疗器械有限公司；电泳仪、转移电泳槽和转移电泳仪购自美国Bio-Rad公司；酶标仪（ELX800）购自美国BioTek公司；流式细胞仪购自BD公司。

2 细胞培养 人肝癌细胞株SMMC-7721置于含有10%的胎牛血清、100U／ml青霉素及100U／ml链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞的生长，待细胞铺满瓶底的80%时进行传代。实验选用对数生长期细胞。

3 细胞生长抑制实验 采用MTT比色法。SMMC-7721细胞接种于96孔板，培养24h后加无血清培养液常规培养24h，换含塞来昔布的培养液，终浓度分别为0、25、50、75和100μmol／L，0μmol／L组为对照组。每浓度4个复孔。分别在加药后24、48和72h后，避光下加入新配制的 20μl MTT（5mg／ml），置37℃、5%二氧化碳培养箱内培养4h，弃培养液，加入二甲基亚砜（DMSO），10min后酶标仪测490nm处吸光度（A）值，根据公式计算细胞生长抑制率（IR）。IR的计算公式为：IR（%）=（对照组A值-实验组A值）／对照组A值×100%。以上实验均重复3次。

4 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞生长至对数生长期时，倒掉旧的培养液。设对照组与实验组共5个组别。孵箱内细胞培育48h后终止培养，胰酶消化后分别制成单细胞悬液。调整待测细胞密度为5×105个／ml后上机检测。

5 RT-PCR检测SMMC-7721细胞COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA表达 取对数生长期的SMMC-7721细胞，按照5×105／孔接种于6孔板中，24h待细胞贴壁后，每孔分别加入不同浓度塞来昔布，不加入药物的孔为对照组。细胞培养48h后，吸去培养液，PBS冲洗3次，用Trizol法提取细胞总RNA，按反转录反应试剂盒说明进行反转录为cDNA，以cDNA为模板PCR扩增COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA，GAPDH 为内参。各自引物序列分别是：COX-2F：5’-TCAAGTCCCTGAGCATCTAC-3’R：5’-CATTCCTACCACCAGCAACC-3’，ERK1／2 F：5’-GGCTTTCTGACCGAGTATGTG-3’，R：5’-GGGTGTCTGTTCTTGTT AGGG-3’，VEGF F：5’-CCT GGT GGA CAT CTT CCA GGA GTA CC-3’R：5’-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3’，GAPDH F：5’-TCATCCCTGCCTCTACTG-3’R：5’-TGCTTCACCACCTTCTTG-3’。PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，退火温度56℃30s，72℃延伸40s，上述3步骤进行30个循环后，再94℃ 继续延伸5min，置4℃ 保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统拍照用Quantity One软件对照片进行灰度值扫描，以目的条带与其相应内参GAPDH的光密度比代表目的基因mRNA的相对水平，实验重复3次。

6 Western blot法检测 COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表达 收集各组细胞，用细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白。BCA法测蛋白浓度后，取40ug蛋白样品进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳后的蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1h后加入抗体孵育过夜。次日TBST洗膜后加入二抗，室温1h后TBST洗膜3次。ECL浸泡后X片曝光，分析结果。所用内参为GAPDH。

7 统计学处理 所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS 13.0软件进行统计处理，应用单因素方差分析，以P＜0.05作为差异有统计学意义标准。

结 果

1 不同浓度塞来昔布对SMMC-7721细胞增殖的影响 见附表。不同浓度塞来昔布处理SMMC-7721细胞24、48、72h后，用MTT法测定细胞增殖，与对照组相比，各实验组A值均有所降低，其中100μmol／L组A值降低更为明显；抑制率随药物浓度增高、作用时间的延长而增高，同一时间点不同浓度组的抑制率之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。表明塞来昔布能有效抑制SMMC-7721细胞的增殖，且抑制作用呈时间和剂量依赖性。

附表 细胞生长抑制试验结果

2 塞来昔布对SMMC-7721细胞凋亡的影响见图1。使用流式细胞术检测细胞凋亡。流式细胞仪分析结果显示，25、50、75和100μmol／L塞来昔布孵育SMMC-7721细胞后出现了明显的凋亡，各实验组的凋亡率与对照组相比，其差异有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度塞来昔布处理后各组细胞凋亡率之间的差异有统计学意义（P＜0.05），SMMC-7721细胞的凋亡率随着塞来昔布浓度的增加而增加。

图1 不同浓度塞来昔布对SMMC-7721细胞凋亡率的影响

3 塞来昔布对SMMC-7721细胞COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA表达的影响 见图2。不同浓度的塞来昔布（25、50、75和100μmol／L）作用于SMMC-7721细胞24h后，与对照组相比，COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA的表达均明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05），且随塞来昔布浓度的增加，三者的表达均呈逐渐下调趋势。

图2 不同浓度塞来昔布对SMMC-7721细胞COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA表达的影响

4 塞来昔布对SMMC-7721细胞COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表达的影响 见图3。Western blot结果显示，实验组与对照组比较COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表达明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度塞来昔布组之间的差异也有统计学意义。

图3 不同浓度塞来昔布对SMMC-7721细胞COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表达的影响

讨 论

肝癌是目前临床上最常见的恶性肿瘤之一，但缺乏有效防治药物。临床肝癌化疗药物的有效率均不足20%，因此，寻找高效低毒的药物成为肝癌治疗的热点。塞来昔布是近年来出现的特异性COX-2抑制剂，Harris等［2］发现其具有预防乳腺癌发生的作用。随后的研究发现，塞来昔布对胃癌、结肠癌、胆管癌、白血病、膀胱癌等多种恶性肿瘤细胞均有抑制生长和促进凋亡的作用［3-4］。在肿瘤侵袭、转移的过程中，MAPK信号通路起着重要作用，其中ERK1／2信号途径具有重要地位。ERK1／2对肿瘤的作用主要体现在促进细胞增殖方面，活化的ERK激酶可作用于其他信号转导途径的关键效应分子，调节细胞周期相关因子和凋亡分子的表达，最终促进细胞增殖和向恶性转化。Schuierer等［5］人研究发现肝癌细胞中ERK1／2活性较正常细胞明显增强。

本实验以既往相关文献报道塞来昔布能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡为依据，以塞来昔布能否抑制体外培养的SMMC-7721细胞增殖、诱导细胞凋亡为切入点，通过观察塞来昔布对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡及 COX-2、VEGF和 ERK1／2 mRNA和蛋白表达的影响，探讨其可能机制。

本实验通过不同浓度塞来昔布处理SMMC-7721细胞后发现，塞来昔布可抑制SMMC-7721细胞增殖，且呈时间和浓度依赖性。在此基础上应用流式细胞仪检测，发现不同浓度塞来昔布处理的SMMC-7721细胞出现了明显的凋亡现象。这些结果与国内外的相关研究结果相一致［6-7］。

本实验在观察塞来昔布具有抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖、诱导细胞凋亡作用的同时，对其机制作了进一步的探讨。目前，COX-2抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的途径主要有两个方面，即COX-2依赖性途径和非COX-2依赖性途径。COX-2依赖性途径主要包括通过抑制COX-2减少前列腺素合成，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡［8-9］。非COX-2依赖性途径抗肿瘤机制目前多家说法不一［10］。本实验结果显示，不同浓度的塞来昔布作用于SMMC-7721细胞后，其细胞中ERK1／2和VEGF的表达均明显下调，且呈浓度依赖性，表明其作用机制可能与ERK1／2信号通路及抑制肿瘤新生血管形成有关。

综上所述，本实验证实了塞来昔布具有抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖及诱导凋亡的作用，为临床上治疗肝癌提供了新的思路。同时揭示塞来昔布抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖及诱导凋亡的作用机制除了与抑制COX-2的活性相关外，还可能与下调ERK1／2信号通路及抑制肿瘤新生血管形成有关，但具体分子机制仍需要进一步深入研究。

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