茶多酚中儿茶素的抑菌效果探究

孙 昊，郝再彬

(桂林理工大学化学与生物工程学院，中国 桂林 541004)

茶叶中富含多酚类物质，统称为“茶多酚”，其主要成分为4种儿茶素类化合物，占茶叶干重的5%～20%.大量的研究表明[1-3]，儿茶素有很好的抑菌效果：抗菌谱广，对有细胞壁和无细胞壁的革兰氏阳性、阴性菌均有明显的抑制作用；抗菌作用强，用药浓度低；在体内外均有抗菌及抗细菌毒素的作用；保护和促进有益菌生长，调节菌群平衡；不易使细菌产生耐药性[4]．本文主要研究儿茶素质量浓度、pH 值和温度对儿茶素抑菌活性的影响，以期为儿茶素应用于天然食品防腐剂奠定基础[5]．

1 材料与方法

1.1 实验材料

质量分数为82%的儿茶素(中国药品生物制品鉴定所)、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氯化钠、铁氰化钾K3Fe(CN)6、二苯基苦基苯肼(DPPH)、磷酸氢二钠、柠檬酸、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸，以上试剂均为分析纯．

1.2 仪器设备

TU-1800S 紫外分光光度计(美国VARIAN公司)；BS110S (塞多利斯)电子天平(北京塞多利斯有限公司)；DK-S24 型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海-恒科技有限公司)；RE-52-99 旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂产品) ；LRH-150-Z振荡培养箱(广东省医疗器械厂)；LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)．

1.3 试验方法

1.3.1 HPLC法测定儿茶素的质量分数[6-11]测定条件：C18反相柱(Dikma, C18, 5 μm, 150×4.6 mm)，流动相为V水∶V甲醇∶V乙酸=74∶25∶1，检测波长278 nm，流动相速度1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃．

1.3.2 茶多酚中儿茶素的抑菌效果研究[12]

(1) 平板菌落计数法测定茶多酚最低抑菌浓度的结果 在已灭菌并装有培养基的培养皿中注入10-7的菌悬液0.2 mL，涂布均匀后晾干．在相对应的培养皿中，加不同浓度的儿茶素溶液(1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0和2.2 g/L)1.0 mL，以无菌水作空白对照，涂布均匀后晾干．晾干后，倒置于30 ℃的恒温箱中培养，24 h后统计菌落数．

(2) 滤纸圆片法[13]研究不同质量浓度和pH值的茶多酚抑菌效果 配制1～8 g/L的茶多酚溶液，分别取10 mL各种质量浓度的茶多酚溶液和10 mL无菌水，把滤纸圆片浸泡其中，0.5 h后使用．配制出pH值为4、5、6、7、8、9和10的5 g/L茶多酚溶液．把已灭菌的直径为5.8 mm的滤纸圆片浸泡在5 g/L茶多酚溶液中，浸泡0.5 h后使用．无菌水作空白对照，取OD值为0.8的菌悬液0.05 mL，倒入融化并冷却至45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基(约15 mL/平皿)中．取浸泡在儿茶素溶液的滤纸圆片，按正三角形排列在倒有培养基的平皿表面．作好标记后，倒置放于30 ℃的恒温箱中培养24 h．24 h后观察并测出其抑菌圈直径．

(3) 茶多酚中儿茶素氧化前后抑菌效果的研究[14]配制质量浓度均为25 g/L的NaHCO3、茶多酚和K3Fe(CN)6溶液．将NaHCO3溶液加入K3Fe(CN)6溶液中搅匀后，再加入茶多酚溶液中搅匀．25 ℃水浴15 min，pH分别调至3.0、7.0、10.0之后用乙酸乙酯分别萃取(每次20 mL，3×3次合计9次)，分别得氧化组分酸性EOFB，简称B；中性EOFA，简称A；碱性EOFC，简称C．分别在35 ℃下将溶液旋转蒸发，得到的浓缩液在30 ℃的真空干燥箱中干燥，干燥后取出，置于4 ℃的冰箱中保存以备用．

氧化后茶多酚的配制：准确称取2.0 mg的A和B样品分别溶于4 mL的无菌水中，滤纸圆片浸泡其中0.5 h．取5 g/L的茶多酚溶液4 mL，滤纸圆片浸泡其中0.5 h．

2 结果与讨论

2.1 HPLC法测定儿茶素质量分数的结果

按1.3.1方法检测标准品和采购的茶多酚样品(见图1～2)，各3次，计算出各种儿茶素的质量分数(表1)．EGCG占总量的55.5%，最高；C为3.52%，最低．

表1 HPLC法检测采购的茶多酚样品中各种儿茶素质量分数

Tab.1 Content of catechins from tea polyphenols sample by HPLC

物理量ECCEGCGECGEGC茶多酚出峰时间/min5.56.07.510.016.0—质量分数/%9.223.5255.5213.0118.73100.00

2.2 茶多酚中儿茶素的抑菌实验结果

茶多酚对4种菌均有抑制作用，且随着茶多酚质量浓度增加抑菌效果呈上升趋势．当茶多酚为1.0 g/L左右时，基本达到了50%抑菌效果；2.0 g/L时，培养皿中无菌落生长，抑菌效果达到100%(表2)．

用滤纸圆片法考察了不同质量浓度茶多酚溶液的抑菌效果(图3，空白直径5.80 mm，图中各个数据为减去空白直径后的数值，下同)．可以看出不同质量浓度的茶多酚溶液对4种菌的生长均有不同程度的抑制作用，且抑菌圈直径图形走势大致呈抛物线型，在茶多酚达到5 g/L时都存在明显的拐点，当茶多酚大于5 g/L时，曲线走势平缓，抑菌效果基本不变．

表2 不同质量浓度的茶多酚对几种菌生长的影响(菌落数调查)

图3 含有不同质量浓度的茶多酚滤纸片的抑菌效果Fig.3 Bacteria growth in different concentrations of tea polyphenols

用滤纸圆片法考察了不同pH值的茶多酚溶液的抑菌效果．图4表明，不同pH值的茶多酚溶液对4种菌的生长均有不同程度的抑制作用，当茶多酚溶液pH为3～8时，茶多酚对4种菌都有一定的抑菌效果，但当pH低于2或者大于9时，茶多酚的抑菌效果较差，且抑菌圈直径图形走势呈典型抛物线型，在pH为5左右时曲线有最大值出现．因此茶多酚溶液在pH 4～6时有最佳抑菌效果.

图4 茶多酚溶液的pH值对菌的生长影响Fig.4 Bacteria growth in different pH values of tea polyphenols

茶多酚氧化前，酸性氧化组分EOFB和中性氧化组分EOFA对4种菌均有抑菌效果(表3)．茶多酚在氧化前最为明显，对4种菌的抑菌效果在10.0～10.5之间；但是一旦被氧化其抑菌效果下降显著，其中中性氧化组分EOFB抑菌效果较好，碱性氧化组分EOFC基本无抑菌作用．

表3 茶多酚氧化前后的抑菌效果(抑菌圈直径mm)

3 讨论

通过抑菌圈实验表明茶多酚中的儿茶素对于草生欧文氏杆菌、枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌以及大肠杆菌均有较明显的抑菌效果，得到最低抑菌浓度为2 g/L，最佳抑菌浓度为5 g/L．儿茶素在强酸及强碱性条件下极不稳定，其分子结构中存在的酚性羟基被氧化而丧失其抑菌活性，而当pH在4～6时，茶多酚抑菌效果最佳．观察氧化前后的抑菌效果可以发现，儿茶素氧化前抑菌圈直径远大于氧化后的直径，说明其抑菌活性主要存在于氧化前．

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