白鹤灵芝中伞形花内酯的HPLC法测定

谢丽莎,龚志强,黄振园,蒙田秀

(广西中医药大学赛恩斯新医药学院,中国 南宁 530222)

白鹤灵芝又名癣草[1]、仙鹤草[2]、仙鹤灵芝草．学名Rhinacanthusnasutus(L.) Lindau，来自爵床科白鹤灵芝属植物白鹤灵芝的干燥枝或叶，其味甘、性温，为我国传统应用的中药．具有润肺止咳、平喘祛痰、清热疏肝、利湿止痒、收敛止血等功效,用于治疗肺热燥咳、肺结核及受到风寒时所产生的咳嗽等症[3-4]．主要分布于我国福建、广东、广西、云南、台湾等地，此外，泰国、印度等东南亚国家也有使用[5]．全世界的白鹤灵芝约有15种，而中国仅1种[6]．我国台湾地区将其作为青春茶之宝，食疗养生、裨益身体，且无副作用．白鹤灵芝泡茶饮，对高血压特别是老年性高血压、糖尿病、动脉硬化、失眠、便秘以及妇女生理调节等顽症具有神奇疗效[5-7]．本文采用HPLC法建立了白鹤灵芝药材中伞形花内酯质量分数的测定方法，为白鹤灵芝药材的质量评价和进一步开发利用提供理论基础．

1 实验部分

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈(色谱纯，美国TEDIA)、甲醇(分析纯，北京化工厂)、超纯水(杭州娃哈哈)、磷酸等其他试剂均为分析纯；4批采收自不同地区的白鹤灵芝(表1)，3批采收时间不同的广西南宁种植白鹤灵芝(表2)，经广西中医药大学刘寿养副教授鉴定为爵床科白鹤灵芝属白鹤灵芝Rhinacanthusnasutus(L.)Lindau干燥叶, 阴干、粉碎过0.354 mm筛．

Agilent1200高效液相色谱仪(DAD检测器，美国安捷伦)；LG-16W 高速微量离心机(北京京立)、KQ-5000E医用超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)、BP211D 电子分析天平(德国赛多利斯)．

表1 不同来源白鹤灵芝根产地及采收时间

表2 广西南宁种植不同生长年限白鹤灵芝

对照品：伞形花内酯对照品为本实验室自制，通过解析其MS、1H NMR及13C NMR数据，与文献[8-11]报道的结构一致；TLC法验证其纯度，均为单一斑点；通过HPLC面积归一化法检测，其纯度大于98%．

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:XtimateTMC18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)．流动相：V(0.1%磷酸水溶液)∶V(乙腈)=75∶25，流速0.8 mL/min，检测波长318 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL，供试品溶液中伞形花内酯与相邻成分达到基线分离，分离度达到1.5以上，理论塔板数不低于3 000．色谱图见图1．

图1 HPLC色谱图(A 伞形花内酯对照品，B 白鹤灵芝样品，1伞形花内酯)Fig.1 HPLC chromatographs(A:Umbelliferone standard substance; B:Rhinacanthus nasutus sapmle; 1:Umbelliferone)

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取伞形花内酯对照品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.200 g/L的溶液，作为对照品溶液．

1.2.3 供试品溶液的制备 取白鹤灵芝样品粉末约5 g，精密称量，置250 mL圆底烧瓶中，准确加入甲醇50.0 mL，称取重量，回流提取30 min，放冷，再称取重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀．精确吸取续滤液25.0 mL，置蒸发皿中，于水浴锅上蒸干溶剂，残渣用甲醇溶解并移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，待用．取上述样品供试液过0.45 μm的微孔滤膜即得．

1.2.4 标准工作曲线的制备 精密吸取上述伞形花内酯对照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析测定其峰面积．以对照品溶液的浓度(X)为横坐标,色谱峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，求出回归方程为:Y=56 510X+5.562 6，r=0.999 8．表明伞形花内酯对照品在浓度为0.008～0.040 g/L范围内，样品峰面积与浓度呈良好的线性关系．

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度考察 精密吸取对照品溶液10 μL，按1.2.1中色谱条件连续进样6次，测定其峰面积，测得伞形花内酯RSD值为0.12%．表明仪器精密度良好．

2.1.2 稳定性考察 取供试品溶液，室温下分别在0，2，4，8，12，24 h内按1.2.1中的色谱条件进样分析，测定其峰面积，在24 h内伞形花内酯峰面积的RSD值为0.76%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定．

2.1.3 重复性考察 取同批次样品精密称取5 g共6份，按1.2.3中方法配制供试品溶液，精密吸取10 μL，按1.2.1中的色谱条件测定，计算伞形花内酯的平均质量分数为0.108 5 mg/g，RSD值为2.81%(n=6)，表明样品的重复性良好．

2.1.4 加标回收率考察 采用加样回收方法，精密称取已知质量分数的样品适量，准确加入一定量对照品，按1.2.1方法测定，计算加样回收率．见表3．

表3 加样回收考察结果

2.1.5 样品测定与结果 分别取不同编号的白鹤灵芝干燥粉末约5 g，精密称定，按1.2.3中供试品制备方法制备，并按1.2.1中的色谱条件进行分析测定，测定峰面积，计算伞形花内酯的峰面积，结果见表4．

表4 白鹤灵芝伞形花内酯质量分数测定结果

3 讨论

为获得伞形花内酯质量分数测定的最佳分离图谱，本实验参考相关文献[12-14]分别考察了不同流动相对伞形花内酯分离度的影响，最后选定V(0.1%磷酸水溶液)∶V(乙腈)=75∶25等度洗脱条件下获得较好分离效果．

通过本实验研究，白鹤灵芝药材中伞形花内酯的质量分数在种植半年以后变化不大．白鹤灵芝种植半年之后约有0.5 m高，叶子鲜嫩也比较茂盛，可采收叶子做药或制成茶包，其伞形花内酯的质量分数已达到较好的水平．但由于多方面原因，本实验只采集了生长了3个月、6个月和15个月的白鹤灵芝药材，白鹤灵芝生长期对其伞形花内酯含量是否达到平衡，有待进一步的研究．

通过对比广西和广东部分地区的白鹤灵芝药材的伞形花内酯质量分数测定结果，广西产的白鹤灵芝质量分数较高，实验表明广西的地理环境、气候很适合白鹤灵芝的种植，因此将种植白鹤灵芝药材作为当地的经济产业，对提高地域经济效益有着重要的意义．

参考文献：

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