生黄合剂对大鼠心肌缺血再灌注损伤的干预作用

闫文翠 王 晶 张维娜 高玉峰 张凤英 李 欣 (承德护理职业学院，河北 承德 067000)

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是心肌缺血后在一定时间内恢复血供，缺血心肌发生的更严重的损伤。MIRI的可能机制有氧化应激损伤、钙超载、炎症反应、细胞凋亡等，如何减轻MIRI一直是医学界研究的热点。生黄合剂由黄芩茎叶总黄酮和生脉饮组成。前期实验研究证明〔1～4〕，生黄合剂具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，黄芩茎叶总黄酮与生脉饮具有交互作用，二者合用的效果优于单独使用。本实验观察生黄合剂预处理对大鼠MIRI的影响，探讨生黄合剂对心肌保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 黄芩茎叶总黄酮(由承德医学院中药研究所提供，采用黄芩茎叶大孔吸附树脂提取法，纯度为61.8%，批号:010608)、生脉饮(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号:1261143)、复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司，批号:110602)。肌酸激酶(CPK)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司，TUNEL试剂盒购自河北博海生物工程有限公司，DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 动物分组、给药及模型制备

1.2.1 动物分组及给药 健康SD大鼠48只，雌雄各半，体重250～300 g，北京大学医学部实验动物科学部提供〔合格证号:SCXK(京)2006-0008〕。随机分为6组，空白对照组、模型组、阳性药物组、生黄合剂低、中、高剂量组，每组8只。空白对照组、模型组灌等体积生理盐水，阳性药物组给予复方丹参滴丸(135 mg/kg)、低、中、高剂量组分别给予不同剂量的生黄合剂(黄芩茎叶总黄酮17.5、35、70 mg/kg均加入5 ml/kg生脉饮溶解)，均按0.5 ml/100 g灌胃，1次/d，给药7 d。给药结束后，除空白对照组(冠脉前降支仅穿线不结扎)外其他组均建立MIRI模型。

1.2.2 MIRI模型制备 大鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉(1 ml/100 g)，取仰卧位固定，用针形电极插入大鼠四肢皮下记录标准肢体Ⅱ导联心电图。颈部正中切口，气管插管，接人工呼吸机。于胸骨左缘3～4肋间切开胸壁，暴露心脏，在左心耳与肺动脉之间结扎左冠状动脉前降支，同时在结扎线与血管之间穿一直径2 mm、长5 mm的硅胶管，结扎30 min;然后剪断结扎线，取出硅胶管，再灌注2 h，空白对照组仅穿线不结扎，同步监测肢体Ⅱ导联心电图。以左心室前壁发绀和同步心电图Ⅱ导联ST段抬高为结扎成功标志，以左心室前壁由发绀渐变红润及ST段降低1/2为再灌注标志〔5〕。

1.3 指标检测

1.3.1 血清CPK、AST、LDH活性的测定 再灌注结束后经心脏采血，4 000 r/min离心10 min，分离血清，置于－20℃冰箱备用，待血清收齐后严格按试剂盒说明书要求检测血清CPK、AST、LDH的含量。

1.3.2 心肌组织TNF-α含量的测定 采血后立即取出心脏，在结扎线以下剪取左心室前壁心肌，其中1/2心肌用10%甲醛固定，石蜡包埋，用于细胞凋亡的检测;另外1/2心肌放入液氮中保存，用于TNF-α的测定。标本收齐后取1 g冻存的心肌，制作组织匀浆，按ELISA试剂盒说明测定各组心肌组织中TNF-α的含量。

1.3.3 心肌细胞凋亡的检测 按TUNEL试剂盒说明书检测心肌细胞凋亡。光学显微镜下观察，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕黄色。每例切片随机选取5个400倍视野，分别计数每个视野的凋亡细胞和细胞总数，以细胞凋亡指数(AI)作为凋亡程度的指标，取5个视野AI的均值。AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中CPK、AST、LDH含量测定 模型组血清CPK、AST、LDH含量高于空白对照组(P＜0.05);与模型组比较，各组药组能明显降低大鼠血清CPK、AST、LDH的含量(P＜0.05);生黄合剂高剂量组比低、中剂量组及阳性药物组降低作用明显(P＜0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠心肌组织TNF-α含量的测定 模型组心肌组织TNF-α含量高于空白对照组(P＜0.05);与模型组比较，各用药组能明显降低大鼠心肌组织TNF-α含量(P＜0.05)，其中以生黄合剂高剂量组作用较为明显，与阳性药物组、生黄合剂低、中剂量组比较差异亦有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 心肌细胞凋亡情况的检测 与空白对照组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡指数明显升高(P＜0.05);与模型组比较，各用药组心肌细胞凋亡指数降低(P＜0.05);生黄合剂高剂量组心肌细胞凋亡指数低于生黄合剂低、中剂量组(P＜0.05)，但高剂量组与阳性药物组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1、图 1。

表1 各组大鼠CPK、AST、LDH、TNF-α含量及AI的比较 (n=8，s)

表1 各组大鼠CPK、AST、LDH、TNF-α含量及AI的比较 (n=8，s)

与空白对照组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05;与高剂量组比较:3)P＜0.05

组别 CPK(kU/L)AST(U/L)LDH(kU/L)TNF-α(pg/g)AI(%)空白对照组 1.98±0.14 264.69±19.09 3.53±0.29 353.53±18 20/0.000 266.587/0.000.15 4.30±1.87模型组 4.20±0.191) 637.52±14.561) 4.12±0.111) 905.20±19.211) 34.82±1.451)阳性药物组 3.34±0.112)3) 457.67±23.752)3) 3.67±0.192)3) 678.33±24.762)3) 21.23±1.652)生黄合剂低剂量组 3.76±0.202)3) 474.74±18.982)3) 3.74±0.252)3) 837.67±23.622)3) 31.51±2.132)3)生黄合剂中剂量组 3.39±0.182)3) 460.83±21.312)3) 3.68±0.212)3) 655.33±17.572)3) 26.71±2.012)3)生黄合剂高剂量组 2.41±0.192) 358.96±15.682) 3.49±0.312) 548.33±21.522) 20.81±1.962)F/P值 172.32/0.000 114.83/0.000 22.13/0.000 494.

图1 各组大鼠心肌细胞凋亡TUNEL染色观察(×400)

3 讨论

MIRI时，心肌细胞内的CK、AST、LDH因释放而减少，血清中CK、SAT、LDH活性增加，所以测定血清中 CK、SAT、LDH 活性能反映心肌组织损伤程度。本研究显示，生黄合剂能显著降低血清中CK、SAT、LDH的活性，减轻MIRI程度。

TNF-α主要由单核巨噬细胞分泌，是一种主要的炎症细胞因子，在MIRI过程中起着重要作用。研究发现〔6〕TNF-α与MIRI关系密切。TNF-α能增加内皮细胞黏附分子的表达，增强中性粒细胞与内皮细胞的黏附，通过促进中性粒细胞释放自由基和一些细胞毒性物，直接损害心肌细胞。本研究提示TNF-α参与缺血再灌注损伤的发生，生黄合剂能显著降低心肌组织中的TNF-α水平，MIRI后引起的机体TNF-α水平升高的机制有待进一步探讨。

研究〔7〕发现细胞凋亡在缺血再灌注过程中发挥着重要作用，特别是在大脑和心脏。细胞凋亡的多少决定着缺血再灌注心肌损伤的严重程度，有效抑制细胞凋亡是促进缺血再灌注后心功能恢复和减轻心肌损伤的重要途径之一。近年来研究〔8，9〕发现，药物预处理可抑制心肌细胞凋亡，降低心肌梗死面积〔10〕，对缺血再灌注心肌细胞具有保护作用。本研究表明生黄合剂有抑制心肌细胞凋亡的作用，与龚明玉等〔8，9〕研究结果一致。

综上，生黄合剂预处理对缺血再灌注损伤大鼠心肌具有保护作用，以生黄合剂高剂量组效果最明显，其作用机制可能通过抑制心肌细胞凋亡和CK、SAT、LDH的释放，降低心肌组织中的TNF-α水平实现的。

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