槲寄生生物碱抗胃癌的作用

曲义坤 丁 隆 刘伟新 夏伟滨 (佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

槲寄生(Viscum)为桑寄生科(Lorantheceae)半寄生常绿小灌木，常寄生于桑科、茶科、山毛茛科、芸香料、蔷薇科和豆科等29科50余种植物上〔1〕。该属植物有30多个种，我国分布11个种，在我国大部分省区都有分布，其中有4种寄生在桑树上〔2～4〕。槲寄生中含有多种活性成分，现已从中分离得到挥发油、黄酮、有机酸等小分子化合物以及多肽、蛋白、多糖等高分子化合物。另据报道，槲寄生的总生物碱具有较强的抗肿瘤作用，是槲寄生中有效的抗肿瘤成分之一，但是未见国内有关从槲寄生中分离生物碱的报道〔5〕。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器设备 DG5O31型酶联免疫检测仪(德国);UV757CRT紫外可见分光光度计(上海玉田分析仪器公司);电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司);HH.CP-T型二氧化碳培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);Olympus倒置荧光显微镜(CKX41);VS-1300U超净工作台 (VS-1300U);96孔细胞培养板(Gibco公司)。

1.1.2 试剂 槲寄生生物碱(Sigma公司);DMEM培养基、优级胎牛血清;DMSO(Gibco公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 药品的配制 称取槲寄生生物碱5 mg溶于2 ml DMSO中，得浓度均为2.5 mg/ml的储备溶液。取储备溶液适量，用DMSO配制一系列不同浓度的药液，4℃ 保存备用。

1.2.2 槲寄生生物碱对癌细胞生长的影响

1.2.2.1 细胞分组 将经处理待分组的细胞分为给药组和对照组两组。给每个药物加药组均各设6个作用时间，每个作用时间设3个平行样品。对照组共设6个作用时间，每个作用时间设3个平行样品。

1.2.2.2 给药实验 给药组细胞分别加相应的药物储备液20 μl，使药物的终浓度均为60 μmol/L。对照组细胞每皿加DMSO 20 μl。细胞放回培养箱继续培养，分别于第 0，1，2，3，4，5，6小时，分别取出加药组和对照组细胞各3皿，分别收集其细胞质并进行循环伏安测定。

1.2.2.3 MTT测定 将96孔板放回培养箱继续培养24 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液，继续培养，小心吸除培养上清液，然后每孔加入DMSO 150 μl并充分震荡，充分溶解蓝紫色沉淀后，用酶联免疫检测仪测定每孔在波长490 nm处的吸光度值(A)。

1.2.3 MTT法研究槲寄生生物碱的作用剂量对癌细胞生长的影响

1.2.3.1 细胞的处理及分组 将状态良好且长满的MCF-7细胞用0.25%胰蛋白酶消化至细胞间隙清晰，加入适量DMEM培养液吹打悬浮，用培养液调细胞浓度为1.0×105cells/ml，用移液枪从此同一细胞悬液中移取细胞悬液各200 μl接种至96孔板内，培养过夜后将其分为对照组和加药组两组。加药组设6个作用剂量，每个作用剂量设3个复孔。对照组共设3孔。

1.2.3.2 给药实验 称取MTT粉末5 mg充分溶于1 ml pH 7.4 PBS中得浓度为5 mg/ml的MTT溶液。加药组细胞分别加相应的不同浓度的药物加药溶液10 μl/孔，并使每种药物加药组的 加 药 终 浓 度 分别 均为：0，5，10，20，40，80，100，120 μmol/L。对照组加 DMSO 10 μl/孔。

1.2.3.3 MTT测定 将96孔连续培养24 h后，每孔加入20 μmol/L的MTT溶液，继续培养，吸除培养上清液，然后每孔加入DMSO 150 μl，充分震荡，溶解蓝紫色沉淀后，用酶联免疫检测仪测定每孔在波长490 nm处的吸光度值(A)。

1.3 数据处理 按公式：细胞毒效应 =(A对照组－A给药组)/A对照组。A对照组是对照孔的吸光度;A给药组是给药孔的吸光度。计算槲寄生生物碱各作用剂量对胃癌细胞的细胞毒效应，用Origin 8.0软件求算IC50。计量资料数据用s表示，做方差分析，组间做t检验。

2 结果

2.1 槲寄生生物碱对癌细胞生长的影响结果 表1可见，MTT法测定不同剂量下对胃癌细胞的抑制率。剂量小于40 μmol/L时，随着剂量的增加，对细胞的抑制率明显增长，几乎成直线增长;剂量在40～120 μmol/L时，细胞抑制率虽然也随剂量的增加而增长，但速度较慢，曲线趋势较平缓。说明在这个区间内槲寄生生物碱的细胞毒作用接近最大的饱和状态。MTT法得到的细胞抑制率的最高值为79.2%。

2.2 MTT法研究槲寄生生物碱的作用剂量对癌细胞生长的影响 表1可见，槲寄生生物碱对胃癌细胞的抑制作用具有剂量依赖性。当槲寄生生物碱剂量在20 μmol/L以下时，随着剂量的增加，细胞的响应电流的两个信号都呈直线形下降，变化非常显著。当槲寄生生物碱的剂量在20～120 μmol/L时，随着剂量的增加，细胞的响应电流的两个信号也下降，但变化幅度比较小。从两个信号的趋势上看，它们的走势是一致的，说明在槲寄生生物碱的剂量依赖性上，两个信号都能用于很好的描述。在高剂量≥10－5μmol/L时，表现为对胃癌细胞的抑制作用;而在低剂量下＜10－5μmol/L时，表现为对胃癌细胞的促进增殖作用。本实验在10×10－6μmol/L～120×10－6μmol/L剂量范围内，槲寄生生物碱对胃癌细胞明显抑制。

表1 槲寄生生物碱剂量与MTT法吸光率的关系( s ，n=3)

表1 槲寄生生物碱剂量与MTT法吸光率的关系( s ，n=3)

作用剂量(μmol/L)吸光度 细胞毒效应(%)1.135±0.012 0 5 1.059±0.015 14.6 10 0.845±0.012 31.1 20 0.730±0.013 43.5 40 0.476±0.014 63.2 80 0.325±0.009 70.9 100 0.302±0.013 75.3 0 120 0.242±0.014 79.2

3 讨论

从抑制率来看，槲寄生生物碱对胃癌细胞的抑制作用有平台期。槲寄生生物碱对细胞抑制作用随给药培养时间的变化曲线，可见两个信号所表示的抑制趋势是一致的。即培养4 d前，随着时间的增加其抑制率明显增长;在培养4～5 d时，抑制率达到最大的平台期;培养5 d后，抑制率随时间增长而下降但是抑制率相差较多。平台期后抑制率下降的原因可能是因为此时对照组细胞因为生长空间的限制而不再增殖，出现衰退现象。因此，给药培养的最佳时间为4～5 d，此时细胞处于营养和空间充足状态，槲寄生表现出最大的抑制细胞生长作用。

1 孙艳秋，刘 珂，王守愚，等.槲寄生的研究进展〔J〕.中草药，2000;31(6)：471-4.

2 陶明煊，吴国荣.槲寄生的研究与开发利用〔J〕.中国野生植物资源，2001;20(6)：14-5.

3 孔德云，罗思齐，李惠庭，等.槲寄生化学成分的研究Ⅰ〔J〕.医药工业，1987;18(3)：123-7.

4 孔德云，罗思齐，李惠庭，等.槲寄生化学成分的研究Ⅲ：槲寄生新苷Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ的结构〔J〕. 化学学报，1988;23(8)：593-600.

5 Beret A，Cazenave JP.Plant Flavonoids in biology and medicine〔M〕.New York：Elsevier Science，1988：187-200.