LKB1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

李作生 王国臣 陈志全 郑贸根 侯静朴 (河北联合大学附属医院胸心外科，河北 唐山 063000)

LKB1即丝氨酸-苏氨酸激酶11(STK11)，是Peutz-Jeghers综合征(PJS)的致病基因。有研究认为，LKB1基因突变在肺癌中非常普遍〔1，2〕，LKB1在肺癌发生、发展、分化和转移中起着非常重要的作用〔3〕。但目前对LKB1蛋白表达情况与非小细胞肺癌的相关性研究少见报道。本文应用免疫组化方法对非小细胞肺癌病人的癌组织及正常肺组织的LKB1蛋白表达情况进行研究，分析LKB1的蛋白表达在非小细胞肺癌中的意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2007～2010年河北联合大学附属医院胸外科手术治疗并经病理确诊的非小细胞肺癌76例(腺癌、鳞癌各38例，高分化肿瘤33例，中-低分化肿瘤43例)。其中男性54例，女性22例;年龄56～78岁，平均年龄66岁。所有病例术前未行放化疗。

1.2 取材处理 所有癌组织均取自癌肿原发灶，避开坏死、炎症区域;正常组织取自距癌肿边缘5 cm以上的正常肺组织(经病理检查证实无转移)。

1.3 免疫组化染色及主要试剂 采用免疫组化非生物素即用型二步法。非生物素即用型二步法染色严格按照试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。实验用一抗为鼠抗人LKB1单克隆抗体ab15095，为美国Abcam公司产品。二抗为辣根过氧化物酶标抗鼠-兔聚合物，与即用型免疫组化 EliVision plus试剂盒(鼠-兔)均为福州迈新生物技术开发有限公司产品。

1.4 结果判定 采取双盲法阅片，由两位病理学专家观察病理切片。判断细胞染色的强度时要求这些着色颗粒清晰可见并定位准确，而且背景清晰。染色深浅需与背景着色相对比。每张切片至少观察4个视野，对所测部位进行准确定位后，由摄像系统提取数值化细胞图像，再用电脑进行形态学分析。LKB1蛋白位于细胞质、细胞核内，显示为棕黄色颗粒。阳性标准(按阳性细胞所占百分比)：≥25%为表达阳性。

1.5 统计学分析 应用SPSS13.0统计学软件进行统计分析。LKB1表达与临床特征的关系用χ2检验。

2 结果

2.1 LKB1在肺癌组织及正常肺组织中的表达 LKB1蛋白在肺癌组织及癌旁正常肺组织中均有表达，其阳性染色呈棕黄色颗粒弥漫性分布于细胞质和细胞核。图1显示LKB1呈棕黄色颗粒。LKB1在肺癌组织中表达的阳性率为65.79%，在正常肺组织的阳性表达率为90.78%，两者比较差异有显著性意义(χ2=13.973，P=0.000)。

2.2 LKB1在肺腺癌和鳞癌中的表达 LKB1蛋白在肺鳞癌组织中的表达阳性率为66.16%，在肺腺癌组织中的表达阳性率为68.42%;两者比较无显著差异(χ2=0.234，P=0.629)。

2.3 LKB1表达与肿瘤分化程度的关系 LKB1蛋白在高分化肿瘤中的表达阳性率(81.82%)明显高于中-低分化肿瘤(53.49%)(χ2=6.658，P=0.010)。

2.4 LKB1表达与淋巴结转移的关系 LKB1蛋白在淋巴结转移阳性组的阳性表达率为52.08%，而在无淋巴结转移组的阳性表达率(89.29%)明显高于淋巴结转移阳性组(χ2=10.875，P=0.001)。

图1 肺癌及癌旁组织LKB1蛋白表达(DAB，×200)

3 讨论

LKB1基因位于人染色体19p，其功能主要是使细胞周期阻滞在G1期、促进细胞凋亡和调节胚胎血管形成等。LBK1蛋白具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，通过磷酸化底物蛋白或与靶蛋白结合，调控基因表达，参与细胞周期调控、细胞凋亡等生命活动〔4，5〕。LKB1几乎在人的所有组织中均有表达。LKB1基因的突变见于各种病理类型的肺癌〔1～3，6，7〕。2002 年 Sanchez-Cespedes实验室首先报道了在肺腺癌中存在相当比例的LKB1功能性缺失突变〔8〕。之后 Matsumoto等〔7〕通过对非小细胞肺癌中腺癌的大规模测序分析亦得出类似结论。Koivunen等〔9〕通过对北美以及东亚原发性肺癌标本的研究得出北美人群相对于东亚人群存在较多的LKB1突变率，以及腺癌多于鳞癌的特点。这些研究提示LKB1的体细胞突变在肺癌发生、发展中起着非常重要的作用。LKB1基因的改变常和其他重要的肿瘤基因突变包括KRAS和TP53并存，尤其是LKB1基因改变经常与另外一个位于染色体19p的肿瘤抑制基因BRG1失活同时发生〔10，11〕，说明肺癌的发生是多种肿瘤基因共同作用的结果。

本研究结果说明在腺癌和鳞癌中均存在LKB1基因异常导致的LKB1蛋白表达的异常。本实验结果显示LKB1蛋白随着肿瘤分化程度的降低其表达阳性率也下降，可能提示LKB1蛋白的低表达导致其对肿瘤的抑制作用减弱，从而导致肿瘤的恶性程度升高。本实验结果也显示出LKB1蛋白表达与淋巴结转移相关，LKB1蛋白低表达者容易发生淋巴结转移，说明LKB1蛋白表达下调也可能减弱了其对肺癌淋巴结转移的抑制能力。这些研究结果说明LKB1具有抑癌作用，其机制可能与其对 VEGF 的调控有关〔12，13〕，LKB1 能够下调 VEGF 的表达，从而抑制肿瘤新生血管产生，达到抑制肿瘤发生发展的作用。

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2 Gill RK，Yang SH，Meerzaman D，et al.Frequent homozygous deletion of the LKB1/STK11 gene in non-small cell lung cancer〔J〕.Oncogene，2011;30(35)：3784-91.

3 Ji HB，Ramsey MR，Hayes DN，et al.LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis〔J〕.Nature，2007;448(7155)：807-10.

4 Karuman P，Gozani O，Odze RD，et al.The Peutz Jegher gene product LKB1 is a mediator of p53 dependent cell death〔J〕.Mol Cell，2001;7(6)：1307-19.

5 Tiainen M，Ylikorkala A，Makela TP.Growth suppression by Lkb1 is mediated by a G(1)cell cycle arrest〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(16)：9248-51.

6 Amin RM，Hiroshima K，Iyoda A，et al.LKB1 protein expression in neuroendocrine tumors of the lung〔J〕.Pathology International，2008;58(2)：84-8.

7 Matsumoto S，Iwakawa R，Takahashi K，et al.Prevalence and specificity of LKB1 genetic alterations in lung cancers〔J〕.Oncogene，2007;26(40)：5911-8.

8 Sanchez-Cespedes M，Parrella P，Esteller M，et al.Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung〔J〕.Cancer Res，2002;62(13)：3659-62.

9 Koivunen JP，Kim J，Lee J，et al.Mutations in the LKB1 tumour suppressor are frequently detected in tumours from Caucasian but not Asian lung cancer patients〔J〕.Br J Cancer，2008;99(2)：245-52.

10 Sanchez-Cespedes M.The role of LKB1 in lung cancer〔J〕.Fam Cancer，2011;10(3)：447-53.

11 Rodriguez-Nieto S，Sanchez-Cespedes M.BRG1 and LKB1：tales of two tumor suppressor genes on chromosome 19p and lung cancer〔J〕.Carcinogenesis，2009;30(4)：547-54.

12 Safe S，Abdelrahim M.Sp transcription factor family and its role in cancer〔J〕.Eur J Cancer，2005;41(16)：2438-48.

13 臧远胜，夏天保，李 强.抑癌基因LKB1对肺癌细胞血管内皮生长因子的表达调控〔J〕.第二军医大学学报，2007;28(6)：624-8.