来氟米特对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠神经功能及血CD4+CD25+T淋巴细胞的影响

刘晓玲 由 玮 左玲莲 宋明君 刘桂霞 石 磊 陈永清 孙德万

(烟台市莱阳中心医院神经内科，山东 莱阳 265200)

多发性硬化(MS)是人类中枢神经系统常见的炎性脱髓鞘 性疾病，其病因和发病机制复杂，一般认为是遗传易感个体与环境因素相互作用而发生的自身免疫性疾病，以髓鞘脱失、神经胶质增生、不同程度的轴索病变和进行性神经功能紊乱为主要特点〔1〕。实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)的病理学、免疫学和临床表现都与MS极为相似，因而成为公认的研究MS免疫病理学机制及其实验性治疗的最佳动物模型〔2〕。CD4+CD25+T细胞是调节性T细胞的亚群之一，能抑制自身反应性T、B细胞的活化增殖以及免疫球蛋白的产生〔3〕。大量实验表明CD4+CD25+T细胞的减少或功能降低会导致自身免疫性疾病的发生。来氟米特(LEF)是一种化学结构独特、作用机制新颖的新型免疫抑制剂，具有免疫抑制及抗增殖作用，与其他免疫抑制剂相比，具有多环节作用(抑制嘧啶合成，抑制蛋白酪氨酸激酶活性等)的特点，并具有抗病毒作用。现临床主要用于治疗类风湿关节炎〔4〕、系统性红斑狼疮在内的自身免疫性疾病;及免疫介导性疾病，如肾炎肾病、移植排异反应等〔5〕，在风湿病、肾脏病、皮肤病、器官移植领域有广阔的临床应用前景。本研究采用EAE大鼠作为动物模型，给予不同剂量LEF及甲泼尼龙治疗，观察药物对大鼠神经功能及血CD4+CD25+T细胞的影响，探讨LEF治疗EAE的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雌性Wistar大鼠100只，体重190～230 g，6～8周龄，由山东省中医药学校实验动物中心提供;健康雌性豚鼠25只，体重300～400 g，由山东省中医药学校实验动物中心提供。均于山东省中医药学校实验动物中心动物房在恒温22℃、相对湿度65% ～70%、光照周期12 h环境中，用标准混合饲料适应性饲养1 w后进入实验。

1.2 主要试剂与仪器 LEF购自苏州长征-欣凯制药有限公司;甲泼尼龙购自大连辉瑞制药有限公司;CD4-FITC单标抗体、CD4-FITC/CD25-PE双标抗体以及相应的对照抗体由美国BD公司提供。

1.3 方法

1.3.1 EAE大鼠模型制备

1.3.1.1 完全抗原的制备 取液体石蜡40 ml、羊毛脂20 g混合，加热并融化制得不完全弗氏佐剂(IFA)，分装入10 ml小瓶高压灭菌后4℃冰箱保存。豚鼠用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射至四肢瘫软，无菌状态下剪开胸腔、剥离心包，0.9%生理盐水左心室灌注直至肝脏变白，迅速取其脊髓，小心剥离脊膜后称重，加入等量生理盐水，制成50%(W/V)全脊髓匀浆(GPSCH)。同时融化IFA，1 ml IFA加入约10 mg的卡介苗，即制得完全弗氏佐剂(CFA)。将CFA与GPSCH等体积混合，在冰上用注射器反复抽推，制成油包水乳液，制成完全抗原，放置冰上备用。

1.3.1.2 模型制备 健康雌性Wistar大鼠100只，随机取12只作为正常对照组，其余88只进行造模。88只大鼠四肢足垫皮下及颈部皮下分别注射完全抗原(GPSCH/CFA)0.1 ml，即0.5 ml/只，足背皮内注射百日咳杆菌抗原0.01 ml/只(含3.0×109个菌体);12只对照大鼠四肢足垫皮下及颈部皮下分别注射等量的生理盐水/CFA乳液。免疫当日记为0 d。

1.3.2 动物模型鉴定

1.3.2.1 神经功能评分 免疫当日和免疫后所有动物每日进行神经功能评分(Duckers评分)〔6〕。0分：不发病;1分：尾部张力降低或轻度步态笨拙;2分：尾部无张力和(或)后肢中度无力;3分：双侧后肢麻痹;4分：后肢麻痹伴前肢力弱或麻痹;5分：因EAE而濒临死亡或死亡。评分≥1分为造模成功。

1.3.2.2 脑、脊髓组织病理检查 模型大鼠采用10%水合氯醛腹腔麻醉后灌注处死。分别取脊髓颈膨大、胸段、腰膨大及全脑，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋、切片，HE染色后光镜观察。

1.3.3 实验分组及给药方法 造模成功且存活的大鼠共50只，与12只对照大鼠共分为5组，按以下方法给药。LEF大剂量组：0.3 mg·kg－1·d－1灌胃给药;LEF 小剂量组：0.2 mg·kg－1·d－1灌胃给药;甲泼尼龙组：30 mg·kg－1·d－1尾静脉注射给药;模型组：等量生理盐水灌胃;对照组：等量生理盐水灌胃。给药时间均为14 d。

1.3.4 神经功能评分 给药后每天观察记录神经功能评分(Duckers评分)。

1.3.5 血CD4+CD25+T淋巴细胞比例观察 给药后第15天，将大鼠以水合氯醛腹腔麻醉后，心脏穿刺取血，EDTA抗凝。取抗凝全血各 100 μl，分别加入 CD4-FITC 10 μl、CD4-FITC 和CD25-PE各10 μl，混匀后室温避光孵育20 min，阴性对照均以同型抗体代替。然后加入1∶10溶血素(FACS溶解液)2 ml，迅速于混旋器上混匀，置室温处放置10 min，以2 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入PBS液2 ml洗涤，以2 500 r/min离心5 min;弃上清液，加入0.5 ml PBS混匀后上流式细胞仪，检测CD4+T细胞、CD4+CD25+T细胞的百分数。

1.3.6 脑、脊髓组织病理检查 心脏取血后立即心脏灌注处死动物，取脊髓及全脑，HE染色后光镜观察。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件行方差分析，各组数据以s表示，进行t检验。

2 结果

2.1 EAE发病动物的神经功能状况 经生理盐水/CFA免疫的12只对照大鼠未出现症状，体重持续增长，活动度正常。经完全抗原免疫的88只大鼠有64只发病，其中1分16只;2分14只;3分14只;4分6只;5分14只，发病率为72.1%。麻醉意外及免疫后急性期死亡8只，评分5分的大鼠在发病达高峰时死亡。造模成功且存活的大鼠为50只，免疫后第12天首例出现临床症状，以后发病数逐渐增多，多数在12～15 d出现症状，症状出现后3～4 d发病达高峰。症状先表现为尾部张力减低，随后出现活动减少、食欲不振、体重下降明显、毛色晦暗、双后肢麻痹，严重者发展为四肢瘫痪、喂食时咀嚼无力、不能进水、尿便障碍至濒临死亡。

2.2 治疗后EAE发病动物的神经功能状况 用药治疗后，EAE大鼠临床症状逐渐缓解，麻痹、瘫痪的四肢逐渐恢复，摄食摄水量增多，活动增加甚至活动灵敏度接近正常。模型组大鼠症状可在造模第20天后开始自行缓解，缓解速度及程度较治疗组小。随着临床症状的缓解，EAE大鼠体重也逐渐增加。

2.3 病理学改变 造模成功的EAE大鼠组织病理学主要表现为急性血管炎改变，脊髓实质内、蛛网膜下腔及侧脑室脉络丛小血管充血，管周有大量炎细胞浸润，形成“血管套”样改变。脑部的炎性灶主要分布于白质内，如丘脑髓纹、视交叉上方、胼胝体等部位，在脑室周围可见不规则的坏死区。脊髓的损害较脑为重，以腰骶段最为显著，白质较灰质明显。对照组的神经组织病理检查未见异常，这与此组未出现临床症状吻合。治疗后各治疗组大鼠脑和脊髓组织病理学改变与模型组相比，均有不同程度减轻，病灶区域的炎性浸润细胞数及“血管套”样改变明显少于模型组，以LEF大剂量组改变最明显(图1)。

2.4 治疗后各组血CD4+T细胞、CD4+CD25+T细胞的百分率比较 见表1。

图1 EAE大鼠脊髓(HE，×200)

表1 各组大鼠治疗后血CD4+T细胞、CD4+CD25+T细胞的百分率比较(%，s)

表1 各组大鼠治疗后血CD4+T细胞、CD4+CD25+T细胞的百分率比较(%，s)

与对照组比较：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;与模型组比较：3)P ＜0.01

组别 n CD4+T CD4+CD25+T LEF大剂量组 12 36.18±1.901)3) 3.44±0.052)3)12 33.31±2.31 3.75±0.06 LEF小剂量组 12 42.07±1.692)3) 2.31±0.111)2)甲泼尼龙组 12 43.12±2.492)3) 2.31±0.051)2)模型组 14 46.47±2.182) 2.20±0.042)对照组

3 讨论

EAE是在实验动物发生的、局限于中枢神经系统的自身免疫反应，是CD4+T细胞介导的以特异性攻击髓鞘的自身抗原引起神经髓鞘损伤为特点的神经系统免疫性疾病。EAE具有与人类MS极为相似的病理学、免疫学和临床特征，成为研究MS的理想动物模型。国内外学者对EAE模型进行了较多研究〔7〕。本实验造模成功后脑脊髓组织切片HE染色可见急性血管炎伴周围髓鞘脱失，小静脉周围有大量炎细胞浸润，形成血管鞘，白质多于灰质，与国内外报道基本一致。

MS现在多用糖皮质激素作为急性发作期的治疗，但短期应用激素对MS长期功能恢复并无明显疗效。环孢素、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤对进展型MS很可能有一定治疗作用，但长期应用副作用较大。免疫球蛋白静滴治疗可缩短病程、加速神经功能恢复，但价格昂贵，且对多次复发者和进展型MS效果不理想。在MS发病机制及病情演化中，细胞免疫与体液免疫均参与了病理免疫过程，免疫异常及免疫细胞的网络调节是其发病的机制，因此应用免疫抑制类药物是MS治疗的主要手段。

LEF是一种新型免疫抑制剂，其免疫抑制作用机制主要表现在两个方面：(1)抑制嘧啶的从头合成途径，阻断淋巴细胞的活化和增殖过程。LEF通过抑制嘧啶从头合成途径的关键酶-二氢乳清酸脱氢酶来阻断嘧啶的从头合成途径〔8〕。(2)抑制酪氨酸激酶的活性，阻断细胞炎症信号的级联传导过程〔9〕。鉴于上述两种独特的作用机制，国外许多学者将该药称为“双重作用免疫抑制剂”。另外，许多基础实验还表明，LEF还能够直接抑制抗体的产生〔10〕，抑制核转录因子NF-JB的活化等。LEF对多种自身免疫性疾病和免疫介导性疾病有确切的疗效和良好的安全性，在风湿病、肾脏病、皮肤病、器官移植领域有广阔的临床应用前景。LEF的不良反应主要表现为脱发、胃肠道反应，但发生率较低，且程度较轻，表明LEF治疗免疫性疾病是安全的，且相对于环孢素A、霉酚酸酯等而言，费用较低，能被大多数患者所接受，不失为经一线免疫抑制剂治疗无效患者的一种选择。

CD4+CD25+T细胞是一类调节性细胞，是在胸腺细胞正常分化时由CD4+CD8+双阳性细胞向CD4+CD8－单阳性细胞转变过程中形成的，在抑制自身反应性细胞增殖、维持免疫环境的稳定方面起着重要作用。CD4+CD25+T细胞数量的减少、抑制功能的受损和(或)表面分子表达的缺陷，都可能导致自身免疫病的发生。Walker等〔11〕报道清除CD4+CD25+T细胞将导致大鼠发生自身免疫性疾病，推测可能是由于CD4+CD25+T细胞的减少导致EAE的发生。CD4+CD25+T细胞的免疫抑制机制主要有以下三种：(1)通过细胞接触发挥抑制作用。这种抑制需要细胞表面的T细胞受体(TCR)活化，然后通过细胞表面的MHC分子进行直接抑制或通过抑制抗原提呈细胞(APC)表达协同刺激分子而进行间接抑制。(2)通过分泌抑制性细胞因子如IF-4、IF-10、TGF-β等发挥抑制作用。(3)通过竞争性抑制，效应性T细胞与调节性T细胞通过竞争实现二者数量及功能上的动态平衡，调节性T细胞可抑制效应性T细胞由于抗原刺激引起的增殖，若抑制失败则会发生MS等自身免疫性疾病，CD4+CD25+T细胞可协调这种动态平衡。近年来，Hori等〔12〕发现叉头状转录因子Foxp3在CD4+CD25+T细胞特异性表达，在CD4+CD25+T细胞的发育上起很重要的作用，无Foxp3的表达就没有CD4+CD25+T细胞。Huan等〔13〕的研究证实MS患者的外周CD4+CD25+T细胞中Foxp3在信使RNA及蛋白水平上均有异常，这种细胞对机体的免疫抑制功能减退与其数量的衰减呈相关性，Foxp3水平的降低通过CD4+CD25+T细胞表现为机体免疫调节的功能障碍，这可能与MS直接相关。

本研究证明LEF作为一种免疫调节剂可以抑制CD4+T淋巴细胞增殖，降低CD4+T淋巴细胞百分数，同时可诱导 CD4+CD25+T细胞百分数增加，其机制可能与细胞间直接接触及抑制性细胞因子IL-10、TGF-β等的参与有关，也可能是通过激活转录因子Foxp3，增强CD4+CD25+T细胞活性来实现的，具体机制有待进一步阐明。

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