EC9706细胞和人食管鳞状细胞癌组织中MAL基因启动子区的甲基化状态

刘伯新，郭长青#，王曼华，王明荣

1)郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052 2)中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室 北京 100021

MAL基因是由Alonso等[1]于1987年分离得到的一个在T细胞分化中晚期表达的基因。研究[2-4]表明MAL基因在多种肿瘤中表达下调或者缺失，DNA甲基化被认为是该基因失活的可能机制之一[5-8]。该研究利用亚硫酸氢盐测序法检测人食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)细胞系EC9706中MAL基因启动子区CpG位点的甲基化情况，并采用甲基化敏感性限制性内切酶酶切结合PCR技术进一步检测食管鳞癌组织MAL基因启动子区的甲基化情况，以期对食管鳞癌发生发展的机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1材料26例食管鳞癌及其配对癌旁正常食管组织取自郑州大学第一附属医院2009年1月至2011年12月住院手术患者，男22例，女4例，年龄46～74(57.2±8.3)岁。其中肿瘤直径≥3 cm 24例，<3 cm 2例；高、中分化19例，低分化7例；侵袭深度未达肌层2例，肌或肌外层24例；有淋巴结转移23例，无淋巴结转移3例；有远处转移20例、无远处转移6例。患者术前均未接受放化疗，所有标本经组织病理学检查证实为食管鳞癌。标本取材后置液氮中速冻，然后置-70 ℃冰箱保存。EC9706细胞由郑州大学基础医学院微生物和免疫学教研室提供，常规培养，至70%～80%饱和密度时收获细胞。

1.2EC9706细胞MAL基因启动子区甲基化检测

1.2.1 基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰及纯化回收

提取EC9706细胞的基因组DNA，采用蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提。DNA样品中加入3 mol/L NaOH 42 ℃水浴30 min，加入新配制的10 mmol/L氢醌30 μL和3.6 mol/L亚硫酸氢钠(pH 5.0)520 μL，加200 μL石蜡油，50 ℃避光水浴16 h。用Wizard DNA Clean-up System(Promega公司产品)纯化DNA。加3 mol/L NaOH 5.5 μL，37 ℃孵育15 min，加1 μg鲑精DNA，加10 mol/L乙酸铵33 μL，再加270 μL冰无水乙醇，-20 ℃过夜沉淀，12 000 r/min离心10 min，加体积分数70%乙醇离心，空气中干燥后加20 μL TE溶液，-20 ℃保存。

1.2.2 PCR扩增 MAL基因启动子区引物序列：上游5’-GTGGTTGGTTTTATTTTTTATTGTAGATTT-3’，下游5’-CAAAAACCACTCACAAACTCAAAAAT-3’，产物大小699 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为25 μL，其中包含DNA 0.5 μL，Master Amp 2×PCR Premix buffer 12.5 μL，引物0.4 μmol/L各1 μL，Taq酶2 U(日本TaKaRa公司)。反应条件：94 ℃预变性5 min后，94 ℃ 40 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 130 s，进行35个循环，最后于72 ℃延伸7 min。PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，用QIAEXⅡ Agarose gel extraction试剂盒回收，将终产物送至大连日本TaKaRa公司进行测序。

1.3食管组织MAL基因启动子区甲基化检测

1.3.1 DNA甲基化敏感性限制性内切酶EheⅠ酶切及纯化 组织标本采用酚-氯仿抽提法提取DNA，50 μL酶切体系内含10×buffer 5 μL，EheⅠ 10 U，基因组DNA 1 μg，上加矿物油200 μL，37 ℃酶切过夜。吸弃矿物油，酚-氯仿抽提纯化DNA。

1.3.2 PCR扩增 MAL基因5’调控区(含启动子区)引物序列：上游5’-TCAGTGGACGCGGAAGG-3’，下游5’-GAGCCACTCACAAACTCAAAGATC-3’，产物大小为724 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系及循环参数同1.2.2。取10 μL上样于1.5 g/L琼脂糖凝胶(含0.1 g/L溴化乙锭)电泳。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用配对χ2检验分析食管鳞癌及配对癌旁正常食管组织中MAL基因启动子区甲基化率的差异，应用Fisher确切概率法分析不同临床病理因素食管鳞癌组织中MAL基因启动子区甲基化率的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1EC9706细胞MAL基因启动子区的甲基化情况EC9706细胞基因组DNA经亚硫酸氢盐修饰后PCR扩增结果见图1。MAL基因启动子区699 bp范围内检测出42个胞嘧啶位点的甲基化，占所有CpG位点的73.7%(42/57)。

图1 EC9706细胞MAL基因启动子区的PCR结果

2.2食管组织中MAL基因启动子区的甲基化情况PCR扩增结果见图2、表1。

图2 2种食管组织MAL基因启动子区PCR结果

表1 2种食管组织中MAL基因启动子区的甲基化情况 例

配对χ2=10.924,P<0.001。

2.3不同临床病理特征患者食管鳞癌组织中MAL基因启动子区的甲基化情况见表2。

表2 不同临床病理特征患者食管鳞癌组织中MAL基因启动子区的甲基化情况

3 讨论

MAL基因表达一个高度疏水性蛋白，即 MAL蛋白，这个蛋白缺少一个疏水的引导肽序列，并包含四个被短亲水片段分离开的潜在跨膜区域[1]。MAL基因可能是高尔基体和远端质膜之间囊泡转运和蛋白质分选的一个功能成分[9-11]。

许多肿瘤组织中MAL基因表达异常，基因甲基化可能是MAL基因失活的主要机制[12]。许智雄等[13]发现MAL基因在92.7%(38/41)食管癌组织中表达显著下调，且在3个食管癌细胞株未见表达，认为MAL基因表达下调是食管癌发生、发展过程中的一个频发事件。Mimori等[14]发现MAL基因在食管上皮细胞的分化和角质化中起调节作用。Zinovyeva等[15]通过cDNA序列分析和RT-PCR对人食管癌和正常食管黏膜组织进行分析，也发现MAL基因在肿瘤组织中表达下调。郭长青等[8]对食管癌MAL基因表达下调机制进行了探讨，对MAL基因的5’调控区进行克隆和序列分析，结果表明食管癌中可能存在MAL基因5’调控区的点突变。根据以上研究推测MAL基因启动子区可能存在甲基化，这可能是食管癌MAL基因表达下调的机制之一。

该研究发现在EC9706细胞中MAL基因启动子区有42个CpG位点的胞嘧啶发生了甲基化，占所有CpG位点的73.7%(42/57)，提示MAL基因启动子区的甲基化可能导致MAL基因转录沉默。该研究亦发现食管鳞癌组织中MAL基因启动子区的甲基化率高于癌旁正常食管组织，不同临床病理特征患者食管鳞癌组织中MAL基因启动子区甲基化率差异均无统计学意义。

综上所述，在食管黏膜的癌变过程中MAL基因启动子区CpG岛可能发生了甲基化，导致MAL基因的转录沉默，表达水平显著下调，从而导致食管黏膜癌变的发生。

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