吸入性糖皮质激素(ICS)对咳嗽变异性哮喘(CVA)的气道高反应性和诱导痰中炎性介质的影响

刘美璇 朱 柠 陈小东

(复旦大学附属华山医院呼吸内科 上海 200040)

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以慢性咳嗽(≥8周)为唯一症状且支气管扩张剂治疗有效的一类特殊哮喘［1］。CVA的发病机制与典型哮喘相似，气道炎症与气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)是其最典型的病理生理特征［2］。如未经规范治疗近30%CVA患者可因出现喘息、胸闷等症状发展为典型哮喘。国内外仍将吸入性糖皮质激素(inhaled corticosteroids，ICS)作为治疗CVA的一线药物，但目前有关ICS对CVA气道高反应性的影响，以及ICS治疗CVA的疗效、最佳疗程尚未明确。因此本研究从CVA的发病机制出发，观察长期吸入激素治疗下CVA的气道反应性和炎性介质水平的变化趋势，以评价ICS的疗效和最佳疗程，为制定CVA的规范治疗提供理论和临床依据。

资料和方法

研究对象 纳入标准:(1)CVA入选符合中华医学会呼吸病学分会2009年制定的《咳嗽的诊断与治疗指南》的标准［3］，(2)均为我院首次诊治的患者，入组前均未应用过任何糖皮质激素治疗。排除标准:肺功能参数FEV1＜70%的受试者，2周内的上呼吸道感染者，长期吸烟者，具有严重心肺疾病患者，长期服用血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)者及妊娠期妇女。本实验纳入2010年11月至2011年3月在华山医院呼吸科门诊确诊的28例CVA患者［CVA组，男13 例，女15 例，平均年龄(42．96 ±14．23)岁］，选取同期华山医院门诊体检部的健康志愿者22例［男12例，女10例，平均年龄(38．76±13．18)岁］作对照组。本研究通过复旦大学附属华山医院伦理委员会审核，所有参加试验者均签署知情同意书。

治疗和检测方法 CVA组受试者入组前进行基础肺功能检测、支气管激发试验(bronchial provocation test，BPT)和诱导痰中细胞因子，入组后开始接受ICS治疗，方案为布地奈德粉吸入剂(每次200 μg，每天2次)，必要时加用万托林。分别于治疗前后 0、3、6、9、12 个月行 BPT 和诱导痰 IL-5、IL-10水平和嗜酸性粒细胞检查，评价ICS对CVA患者的影响。

肺功能检测和BPT应用Master Screen Body型肺功能仪(德国Jaeger公司)测定，测定方法和指标评估根据ATS标准［4］。BPT使用计算机化定量喷射式全自动激发试验系统(APS气雾激发系统)雾化吸入法，所选药物为磷酸组胺(上海蓝季科技发展有限公司，5 g/瓶)，首先测定基础肺功能及吸入生理盐水2 min后第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV1)，以最佳 FEV1值作为基础对照值，然后从 0．03 ～7．8 μmol逐步吸入不同剂量组织胺并监测FEV1，当FEV1较基线下降≥20%对照值为激发试验阳性。以FEV1较对照值下降20%的最低累积剂量(PD20-FEV1)为试验的反应阈值，反映气道的敏感性:阈值越低，气道越敏感，以此评价气道高反应性程度。

诱导痰中细胞因子的检测 用Pin等［5］改进的诱导痰方法:雾化前生理盐水漱口、擤鼻，减少唾液、鼻后滴流对唾液的污染。吸入沙丁胺醇200 μg 10 min后测FEV1作为基础值。本研究采用高渗盐水梯度法，先以3．5%高渗盐水超声雾化吸入7 min(德国Paryboy公司)，鼓励患者用力咳痰至无菌培养皿，若无痰或痰量不足则换用4%高渗盐水继续雾化7 min，若仍未收集合格痰标本则换用4．5%的盐水继续雾化吸入，7 min终止诱导，直至收集到痰标本3～5 mL。每次雾化吸入完毕后都要测FEV1，期间患者出现喘息、气急、胸闷等症状，或FEV1下降≥基础值20%应立即停止操作。操作时间超过20 min仍未成功诱导的受试者排除。

诱导痰标本应在2 h内处理。挑取痰液中黏稠部分，加4倍体积0．1%的二硫苏糖醇(DTT)，用巴斯特吸管反复吹打混匀15次，漩涡器震荡30 s，于37°C水浴10～20 min，直至痰液标本均质化，48 μm尼龙网膜过滤，常温750×g离心沉淀10 min，上清液－80℃冻存待测，细胞沉渣涂片采用瑞-吉姆萨染色，高倍镜下计数400个非鳞状上皮细胞，计数炎症细胞中嗜酸性粒细胞的百分比。鳞状上皮细胞＜20%为合格痰。

用双抗体夹心法酶联免疫吸附测定(ELISA)诱导痰上清液的IL-5、IL-10试剂盒(美国PeproTech’s公司)，操作按说明书要求进行。灵敏度分别不低于15 pg/mL、10 pg/mL。

结 果

基本临床资料 所有研究对象全部完成试验，无中途退出或失访，整个研究过程无任何不良反应发生。CVA组血EOS百分比和过敏特性显著高于健康组(P＜0．05)，两组间其他指标差异无统计学意义(表1)。

ICS对CVA患者PD20-FEV1的影响 随ICS治疗时间延长，CVA组PD20-FEV1逐渐增加，其中ICS干预3个月后 PD20-FEV1即出现显著增加(P＜0．05)，由(0．58 ±0．73)μmol上升至(1．19 ±0．69)μmol(P＜0．05)，治疗12个月后CVA组患者气道高反应性趋近于极轻度水平(2．09±0．36)μmol。CVA 组在治疗 3、6、9、12 个月后，分别 3、7、9、14例患者BPT转阴，ICS治疗12个月后，CVA组BPT转阴率为50%。

表1 入选者的基本临床资料Tab 1 Clinical characteristic of all subjects(±s)

表1 入选者的基本临床资料Tab 1 Clinical characteristic of all subjects(±s)

(1)vs．Healthy group，P＜0．05．

P0．9200．513 0．224 0．1020．000 0．000

ICS治疗前后CVA患者诱导痰IL-5、IL-10及EOS的变化 ICS治疗前CVA组诱导痰中IL-5、EOS百分比显著高于健康对照组(P＜0．05)，IL-10含量显著低于健康对照组(P＜0．05，表2)。CVA组诱导痰IL-5及EOS水平分别在ICS干预3个月、6个月后较基线水平出现明显变化(P＜0．05)，但干预12个月后CVA组各炎症观察指标仍显著高于健康对照组(P＜0．05)。而IL-10在干预6个月后出现显著升高(P＜0．05)，但干预12个月后仍显著低于健康对照组(P＜0．05，表3、4)。

表2 两组诱导痰IL-5、IL-10和嗜酸性粒细胞百分比的基线水平Tab 2 The baseline levels of IL-5，IL-10 and EOS in the two groups (±s)

表2 两组诱导痰IL-5、IL-10和嗜酸性粒细胞百分比的基线水平Tab 2 The baseline levels of IL-5，IL-10 and EOS in the two groups (±s)

(1)vs．Healthy group，P＜0．05．

Inflammatory mediators CVA group Healthy group P0．0070．0180．031

表3 CVA组治疗前后不同时间点诱导痰IL-5、IL-10含量和EOS百分比Tab 3 The levels of IL-5，IL-10 and EOS in induced-sputum of CVA patients during the ICS treatment(±s)

表3 CVA组治疗前后不同时间点诱导痰IL-5、IL-10含量和EOS百分比Tab 3 The levels of IL-5，IL-10 and EOS in induced-sputum of CVA patients during the ICS treatment(±s)

(1)vs．Before treatment，P＜0．05．

12 months after treatment62．73 ±24．92(1)36．35 ±9．24(1)6．15 ±4．93(1)

表4 治疗前后不同时间点CVA组诱导痰IL-5、IL-10含量和EOS百分比的重复测量比较统计值Tab 4 Multiple comparisons of inflammatory mediators between and after ICS treatment by repeated measures

讨 论

CVA作为支气管哮喘(简称哮喘)的起始阶段，其病理基础和病理生理特征与哮喘具有高度的相似性。绝大多数的研究结论已证实Th1/Th2失衡即Th2免疫反应占优势是哮喘发病机制的基石［6］:Th2型细胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13等，通过各种机制参与哮喘的气道炎症进程。调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是近年来提出调控气道炎症的重要细胞，是关于哮喘发病机制的另一研究热点，Treg可分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β，对效应T细胞产生抑制作用［7］，其中IL-10作为多种细胞合成分泌的一种“细胞因子合成抑制因子”，可诱导和维持过敏原免疫耐受，下调Th2型细胞因子的合成，抑制肺部促炎因子和趋化因子的转录。因此，本研究选择诱导痰中Th2相关因子IL-5、负性调控因子IL-10和免疫效应细胞EOS作为CVA慢性炎症的量化观察指标，探讨CVA患者的气道炎症机制及其在ICS治疗过程中的趋势，以阐明ICS治疗CVA的炎症变化规律。

目前治疗CVA的首选药物为ICS［8］，ICS进入肺部，通过与表达在靶细胞胞质内的糖皮质激素受体特异性结合，影响多种炎性基因的转录，从而发挥抗炎症作用［9］。Shimoda等［10］报道早期应用 ICS 可阻止CVA向典型哮喘发展。Chaudhuri等［11］发现吸入氟替卡松14天即可使CVA咳嗽程度减轻，同时降低诱导痰ECP和呼出气NO等炎性介质的水平。

本研究中用布地奈德粉吸入剂治疗CVA患者，治疗前CVA组诱导痰中IL-5含量和EOS百分比水平明显高于健康对照组，CVA患者的IL-10含量低于健康对照组，这与既往的报道一致［12－14］，提示CVA是以嗜酸性粒细胞为主的多种炎性细胞浸润导致的气道慢性炎症。ICS治疗后各种炎性因子皆有不同程度的恢复，进一步证实ICS能通过抑制IL-5分泌、减少嗜酸性粒细胞数量及提高IL-10水平来调节机体免疫环境，改善气道炎症［15］。至随访期结束，CVA的炎症程度较治疗前显著改善，但仍未达到健康组水平。这说明CVA炎性介质的改善对于早期应用ICS反应较为敏感，另一方面亦提示CVA气道炎症的完全消退仍需要ICS的长期维持。本研究进一步发现ICS短期(3个月)治疗CVA可以改善患者的气道高反应性，且治疗后各时间点皆有不同数量患者BPT转阴。本实验中观察到:CVA组在治疗 3、6、9、12 个月后，分别 3、7、9、14 例患者 BPT转阴。尽管ICS的3个月短期疗程可显著改善CVA患者的气道炎症和AHR，但是对于大部分CVA患者来说，仍需更长时间的ICS治疗来完全消除气道炎症以使AHR转阴。从本研究的ICS治疗12个月只有50%(14例)的AHR转阴率来看，大多数CVA患者的ICS疗程显然需要在12个月以上。

综上所述，12个月ICS治疗可以显著降低CVA患者的AHR和气道炎症，但AHR的转阴和气道炎症的完全消退则需要更长期的ICS维持治疗。由于本研究病例数较少，随访期过短，缺乏多中心大样本的研究，有关ICS应用于CVA的最佳疗程仍需要进一步的研究。

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