新型脱水穿心莲内酯环磷酸酯类衍生物的合成及其抗肿瘤活性*

吕巧莉， 涂国刚， 詹建锋， 王嘉琦， 李少华

(南昌大学 医学院 药学系，江西 南昌 330006)

有机磷化合物是一类生命过程中极其重要的物质，许多内源活性物质都含有磷酸酯结构单元，他们参与了能量转化、物质代谢、遗传表达等几乎所有的生命过程[1]。在过去的研究中，有机磷药物作为抗肿瘤药有重大发现并应用于临床，如广谱抗肿瘤药环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰氮芥、阿替哌、碘替哌、噻替哌、氯磷酰胺，膦西洛普利及双二甲磷酰胺乙酯等等。文献[2～4]报道，穿心莲内酯衍生物大多具有良好的生物活性。因其具有内酯环及1，3-二醇的结构，其衍生物具有抑制肿瘤细胞生长及抗HIV活性[5～7]。

本文以穿心莲内酯(2)为先导化合物，对其3-位和19-位进行结构修饰，设计并合成了3个新型的脱水穿心莲内酯环磷酸酯类衍生物(1a～1c， Scheme 1)，其结构经1HNMR， IR和MS表征。初步的体外抗肿瘤活性测试结果表明，1a～1c对舌癌Tca-8113细胞具有较好的体外抑制活性。

本文通过在2的3-位和19-位引入环磷酸酯与环磷酰胺结构，有利于提高药物的脂溶性，从而可望提高药物的选择性，降低其毒性。通过测定1a～1c的生物活性，并研究其对母体生物活性的影响，为进一步设计合成该类化合物提供实验依据,以期发现新型、 高效低毒、有应用前景的抗肿瘤药物。

CopmabcR21232527-O212325-ON2122Cl2324Cl-

Scheme1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BRUKER ADVANCE 600 M型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂,TMS为内标)；Perkin Elmer Spe 1645, 1595, FT-IR型红外光谱仪(KBr压片);ZQ-4000/2695型质谱仪。

磷酰二氯氮芥(3c)参考文献[8]方法合成；其余所用试剂均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；舌癌Tca-8113细胞，武汉大学细胞典藏中心。

1.2 合成

(1)1a和1b的合成

在反应瓶中加入PClO316 mL(0.18 mol)，搅拌下分3次加入1-萘酚865 g(60 mmol)，加毕，加入氯化钠1 g，缓慢加热至回流，反应24 h(直至无HCl气体放出)。于160 ℃蒸出过量的三氯氧磷得淡黄色油状液体二氯磷酸酯3a。

在反应瓶中加入26.3 g(18 mmol)和无水吡啶30 mL,搅拌使其溶解;冰浴冷却，搅拌下缓慢滴加3a156 g(60 mmol)的二氯甲烷(19.17 mL)溶液,滴毕，反应1 h；于室温反应3 h。过滤，滤液减压蒸干得油状液体，用氯仿溶解，依次用稀盐酸(2×40 mL)和水(3×50 mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂得黄色固体，经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶2]纯化得淡黄色固体脱水穿心莲内酯-3,19-环磷酸-1-萘酯(1a)。

用苯酚替代1-萘酚，用类似的方法合成3b和淡黄色固体脱水穿心莲内酯-3,19-环磷酸苯酯(1b)。

1a： 产率83.7%；1H NMRδ： 0.83(s, 3H， 20-H), 1.34(m, 1H， 5-H), 1.34～1.82(m, 2H， 6-H), 1.36～1.70(m, 2H， 1-H), 1.47(s, 3H， 18-H), 2.05～2.29(m, 2H， 2-H), 2.12～2.44(m, 2H， 7-H), 2.29(m, 1H， 9-H), 3.94～4.04(m, 2H， 19-H), 4.18(m, 1H， 3-H), 4.50～4.73(brs, 2H， 17-H)， 4.89(d,J=5.4 Hz, 2H， 15-H), 6.07(d,J=13.4 Hz, 1H， 12-H), 6.64(m, 1H， 27-H)， 6.81(dd, 1H， 11-H), 7.12(br s, 1H， 26-H), 7.37(m, 1H， 22-H), 7.37(m, 1H， 23-H), 7.37(m, 1H， 25-H), 7.50(t, 1H， 14-H)， 7.62(d,J=7.8 Hz, 1H， 24-H), 8.10(d,J=7.8 Hz, 1H， 21-H)； IRν: 3 066, 2 495, 2 852, 2 360, 1 762, 1 645, 1 596, 1 573, 1 463, 1 448, 1 392, 1 290, 1 259 cm-1; MSm/z： 520.89[M+H+]。

1b： 产率80.9%；1H NMRδ: 0.9(d,J=6.6 Hz, 3H， 20-H)， 1.30～1.73(m, 2H， 1-H), 1.30(m, 1H， 5-H)， 1.30～1.84(m， 2H， 6-H), 1.45(s, 3H， 18-H), 2.14～2.48(m, 2H， 2-H), 2.14～2.64(m, 2H， 7-H), 2.29(m, 2H， 9-H), 3.87～4.04(m, 2H， 19-H)， 4.17(m, 1H， 3-H)， 4.58～4.80(brs, 2H， 17-H)， 4.92(dd,J=2.4 Hz, 11.4 Hz， 2H， 15-H)， 6.86(dt,J=10.2 Hz, 14.4 Hz， 1H， 12-H), 7.17(m, 1H， 22-H), 7.17(m, 1H， 26-H)， 7.22(m, 1H， 25-H), 7.33(m, 1H， 14-H), 7.33(m, 1H， 24-H)； IRν： 3 076, 2 945, 2 854, 2 341, 1 755, 1 643, 1 589, 1 489, 1 456, 1 398, 1 296, 1 188, 1 163 cm-1； MSm/z： 471.11[M+H+]。

(2)1c的合成

在反应瓶中加入3c4 g(15 mmol)和二氯甲烷5 mL,搅拌使其溶解；冰水浴冷却下缓慢滴加2 1.63 g(4.65 mmol)的混合液(先用吡啶4 mL热溶，再加二氯甲烷5 mL稀释),滴毕，反应30 min；于室温反应8 h,静置过夜。过滤，滤饼用二氯甲烷(2×10 mL)洗涤，合并滤液和洗液，减压蒸除溶剂得油状液体，用三氯甲烷溶解后，用水(3×40 mL)萃取，有机层用无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂得淡黄色固体脱水穿心莲内酯-3,19-环磷酰(二氯二乙基)胺(1c),产率84.7%；1H NMRδ: 0.92(d,J=6.6 Hz, 3H， 20-H), 1.27(m, 1H， 3-H), 1.30(m, 1H， 5-H)， 1.30～1.60(m, 2H， 1-H), 1.30～1.83(m, 2H， 6-H), 1.36(s, 3H， 18-H), 2.02～2.32(m, 2H， 2-H), 2.32(m, 1H， 9-H), 2.41～2.49(m, 2H， 7-H), 3.44(m, 2H， 21-H), 3.44(m, 2H， 23-H)， 3.61(m, 2H， 22-H), 3.61(m, 2H， 24-H)， 3.97(t,J=4.0 Hz 2H， 19-H)， 4.58～4.82(brs, 2H， 17-H), 4.90(dd,J=10.2 Hz, 1H， 15-H), 6.14(dd,J=4.2 Hz, 14.2Hz, 1H， 11-H), 6.86(m, 1H， 12-H), 7.48(dd,J=6.2 Hz, 7.2 Hz, 1H， 14-H)； IRν： 3 433, 2 943, 2 854, 2 503, 2 360, 1 757, 1 714, 1 627, 1 458, 1 396,1 298, 1 085, 983, 935 cm-1； MSm/z: 518.11[M+H+]。

2 结果与讨论

2.1 合成

到目前为止，仅有一篇文献[9]报道过脱水穿心莲内酯环磷酸酯的合成，其采用的合成方法是：将2，三氯氧磷，吡啶和二氯甲烷反应，首先制成脱水穿心莲内酯-3,19-环磷酰氯，然再与乙醇反应，加入少量DMAP与吡啶作为催化剂与缚酸剂，最终制得脱水穿心莲内酯环磷酸乙酯。由于空间位阻的影响，该方法不适用于大分子伯醇、仲醇与伯胺、仲胺等。

本文对文献[9]方法进行工艺改进，首先将各种含羟基的化合物(包括伯醇、仲醇、酚类)及含氮(伯胺、仲胺)化合物与三氯氧磷反应，由于三氯氧磷活性较高，可较易制得二氯磷酸酯(3)； 3再与2的3-位和19-位羟基反应，可以较高产率生成脱水穿内酯-3,19-环磷酸酯类与环磷酰胺类化合物。

在3的合成中，我们曾尝试了更缓和的反应条件[10]，但是由于涉及到的试剂与操作步骤多，易引入水，使生成的产物又分解，降低产率，影响测试结果。为此采用直接将酚，NaCl和三氯氧磷进行回流反应制备3。

在1的合成中，除反应过程需绝对的无水操作外，还应注意由于反应过程中3的活性极高，而2本身具有五元内酯环，结构不稳定，当遇到强酸或强碱时或反应时间延长，均可使之开环，大大降低产率，且不易分离纯化，所以需要缓和的反应条件，在此反应过程中所有试剂均需进行除水，温度控制在-5 ℃～-15 ℃，反应时间控制在冰盐浴1 h,常温3 h。

2.2 生物活性测试及结果

取舌癌Tca-8113细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，于37 ℃， 100%湿度，5%CO2培养箱中培养并进行传代。后取于对数生长期细胞按5 000个/孔接种于96孔的培养板，加入1，使最终浓度分别为1.0×10-4mol·L-1(A), (1/2)×1.0×10-4mol·L-1(B)和(1/2)2×1.0×10-4mol·L-1(C)。每组6个平行复孔，并以单纯细胞组作为空白对照，置于培养箱孵育24 h。待96孔板中加药各组细胞的药物作用24 h后，在每孔细胞中加入20 μL新鲜配制的0.5%MTT试剂，置于培养箱继续避光作用4 h～5 h后，小心弃去孔内培养液。于各孔中加入DMSO 150 μL，避光振荡15 min，使结晶物溶解充分。设定570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收度并计算细胞抑制率，结果见表1。

表 1 1对舌癌细胞的抑制率*Table 1 Inhibition rate of 1 on Tca-8113

*A=1.0×10-4， B= (1/2)×1.0×10-4， C=(1/2)2×1.0×10-4

由表1可见，1a～1c均具有抗肿瘤活性，其中1c的抗癌效果最好。

3 结论

本文合成了3个新型的脱水穿心莲内酯环磷酸酯类与环磷酰胺衍生物。该方法新颖，原料易得，成本低，过量三氯氧磷可回收利用，无三废。

3个化合物对舌癌细胞有不同的抑制率，可为进一步以穿心莲内酯为先导化合物开发出更高效低毒的环磷酸酯类与环磷酰胺类抗肿瘤新药奠定基础。

[1] 陈茹玉,刘纶组. 有机磷化学研究[M].北京:北京高等教育出版社,2001.

[2] 白霞,马玉东,穆洪,等. 穿琥宁对致热大鼠下丘脑组织中PGE2和cAMP含量的影响 [J].中国临床药理学与治疗学，2005,10(1):75-78.

[3] 郑敏，尹时华，吴基良，等. 穿心莲内酯对大鼠脑缺血，再灌注损伤的影响[J].医药导报，2004，23(10)：708-710.

[4] 刘国利,刘永琼. 穿心莲内酯的研究进展[J].医药导报,2006,25(1):48-50.

[5] 戴桂馥,赵进,王庆端,等. 穿心莲内酯诱导人食管癌Ec9706细胞凋亡机制研究[J].中国药理学通报,2009,25(2):173-176.

[6] FAN Qian-qian， WANG Qiu-juan， ZENG Bu-bing，etal. Synthesis and antitumor effect of novel andrographolide derivatives[J].Journal of China Pharmaceutical University，2010，41(4):326-332.

[7] Calabrese C, Berman S H， Babish J G，eta1. Aphase I trial of andrographolide in HIV positive patients and normal volunteers[J].Phytother Res,2000，14(5):333-338.

[8] Stec W J. Cyclophosphamide and its congeners[J].Organophosphorous Chem,1982,13:145-174.

[9] XU Hai-wei, ZHANG Jian-ye， LIU Hong-min，etal. Synthesis of andrographolide cyclophosphate derivatives and their antitumor activities[J].Synthetic Communicatiaons,2006,36:407-414.

[10] T K Venkatachalam, S Qazi， F M Uckun. Synthesis and metabolism of naphthyl substituted phosphoramidate derivatives of stavudine[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry，2006，14：5161-5177.