澳洲茄胺单糖苷的合成及其抗肿瘤活性*

丁 丹, 沈平孃, 祁双红, 汤秀珍, 邹莲华, 杜晨杰, 卓 超

(1. 华东理工大学 药学院，上海 200237; 2. 国家中药制药技术工程研究中心,上海 201203)

茄科类植物龙葵是我国民间常用于治疗肿瘤的一种草药[1]。 龙葵提取物中主要成分为澳洲茄边碱和澳洲茄碱,它们是澳洲茄胺(4)的两个三糖苷化合物,对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[2～6]。近年来,国内外关于甾体糖苷的合成,抗肿瘤活性及其作用机制的研究较多[7～11]。然而关于4的糖甙化和结构修饰的报道不多。本课题组对4进行3-位糖甙化合成,并筛选抗肿瘤活性,探索在4的3-位羟基引入不同的单糖对抗肿瘤活性的影响。

本文以单糖[D-葡萄糖(1a)， D-半乳糖(1b), L-鼠李糖(1c), D-氨基葡萄糖(1d)和L-阿拉伯糖(1e)]进行4的单糖苷化。1a～1e经苯甲酰化保护及溴代制得中间体酰化溴代糖3a～3e。用Koenigs-Knorr合成法将3a～3e与4进行甙化缩合及脱保护基反应合成了5个澳洲茄

Ar=

Scheme1

胺单糖苷(5a～5e， Scheme 1),其结构经1H NMR,13C NMR和MS表征。其中5a和5b分别是γ-solamargine和γ-solasonin属天然澳洲茄胺单糖苷,而5c, 5d和5e是非天然澳洲茄胺糖苷化合物，5d和5e是新化合物。采用MTT法对人肺癌细胞(A549),人肝癌细胞(QGY7703),人白血病细胞(HL-60),人肠癌细胞(Colo205)和人乳腺癌细胞(MDA-MD-435,231)进行了体外抗肿瘤活性试验。结果显示在4的3-位引入不同的单糖，增强了其抗肿瘤活性, 其中5c和5d的活性要强于5a, 5b和5e; 5d对MDA-MB-231和HL-60有较好的抑制活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SGW X-4型显微熔点仪(温度未校正);Brukor AVANCE(400 MHz或100 MHz)型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标);HP5989A型低分辨质谱仪(EI-MS)； Finigann MAT 8401型高分辨质谱仪(HR-MS); WellscanMK-2型全自动酶标仪。

培养液(RPMI1640+10%FBS+双抗)，A549， QGY7703， HL-60， Colo205和MDA-MB-435,231,上海医药工业研究院；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1)3的制备(以3a为例)

在反应瓶中加入1a4 g(22 mmol),二氯甲烷60 mL和三乙胺13.6 g(130 mmol),搅拌下于-4 ℃滴加苯甲酰氯14.3 mL(120 mmol)，滴毕，于室温反应16 h。加水60 mL和二氯甲烷30 mL，分液，有机层依次用水，稀盐酸，饱和NaHCO3溶液和饱和NaCl溶液洗涤，无水MgSO4干燥，旋干溶剂得黄色浆状粗品,丙酮/水重结晶得白色固体1,2,3,4,6-五-O-苯甲酰-β-D-葡萄糖(2a)10.8 g。

在反应瓶中加入2a10.8 g(15.4 mmol)和二氯甲烷70 m，冰浴冷却,搅拌下滴加30%溴化氢5.5 mL(30.0 mmol)的醋酸溶液,滴毕，于室温反应8 h。加冰水50 mL，依次用冰水(3×50 mL),饱和碳酸氢钠溶液(4×55 mL)和饱和NaCl溶液(2×55 mL)洗涤,无水MgSO4干燥,旋干溶剂得浅黄色浆状粗品,用乙醚/石油醚重结晶得白色粉末1-溴-2,3,4,6-四-O-苯甲酰-α-D-吡喃葡萄糖(3a)6.48 g。

用类似的方法合成白色固体3b～3e。

3a： 收率45.0%(以1a计，下同),m.p.128 ℃～129 ℃,；1H NMR(CDCl3)δ： 6.89(d,J=4.0 Hz, 1H, 1-H), 5.36(dd,J=10.0 Hz, 4.0 Hz, 1H, 2-H), 5.85(t,J=10.0 Hz, 1H, 3-H), 6.29(t,J=10.0 Hz, 1H, 4-H), 4.76(m, 1H, 5-H), 4.69(dd,J=12.4 Hz, 2.4 Hz, 1H， 6-Ha), 4.53(dd,J=12.4 Hz, 2.4 Hz, 1H， 6-Hb)。

3b： 收率67.2%, m.p.130 ℃～132 ℃；1H NMR(CDCl3)δ： 8.10～7.26(m, 20H, PhH), 7.00(d,J=4.0 Hz, 1H, 1-H), 6.14 (d,J=3.2 Hz, 1H, 2-H), 6.08(dd,J=10.4 Hz, 3.2 Hz, 1H, 3-H), 5.70(dd,J=10.8 Hz, 3.6 Hz, 1H, 4-H), 4.95(t,J=6.0 Hz, 1H, 5-H), 4.67(dd,J=12.0 Hz, 6.8 Hz, 1H, 6-Ha), 4.49(dd,J=11.2 Hz, 6.0 Hz, 1H, 6-Hb)。

3c： 收率73.9%， m.p.162 ℃～164 ℃；1H NMR(CDCl3)δ： 8.11～7.29 (m, 15H, Bz-H), 6.57(s, 1H, 1-H), 6.21(dd, 1H, 3-H), 5.89(dd, 1H, 2-H), 5.79(t, 1H, 4-H), 4.44 (m, 1H, 5-H), 1.44(d, 3H, CH3)； EI-MSm/z: 459.1[M-79(-Br)]。

3d： 收率71.4%, m.p.126 ℃～127 ℃；1H NMR(CDCl3)δ： 8.16～7.23(m, 20H, PhH), 6.39(d,J=7.2 Hz, 1H, 1-H), 5.92(d,J=8.6 Hz, 1H, NH), 5.64(d,J=8.0 Hz, 1H, 2-H), 5.94(s, 1H, 3-H), 4.68(m, 1H, 4-H) , 4.06(m, 1H, 5-H), 4.69(dd, 1H, 6-Ha), 4.52(dd, 1H, 6-Hb)；13C NMR(CDCl3)δ: 166.1, 165.1, 165.0, 164.7, 133.5, 133.4, 133.1, 132.3, 130.0, 129.7, 129.5, 129.3, 129.1, 128.7, 128.6,128.5, 128.4, 128.3, 126.4, 99.8(C1), 69.6(C3), 68.4(C2), 68.3(C4), 64.5(C6), 64.2 (C5)。

3e： 收率35.0%， m.p.122 ℃～125 ℃；1H NMR(CDCl3)δ： 6.68(d,J=3.6 Hz, 1H, 1-H), 5.80(s, 1H, 4-H), 5.78(dd, 1H, 3-H), 4.44(dd, 1H, 2-H), 4.29(dd, 1H, 5-Ha), 4.11(dd, 1H, 5-Hb)；13C NMR(CDCl3)δ: 166.1, 165.9, 165.7, 133.5, 133.4, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.2, 128.9, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 91.3(C1), 70.2( C5), 69.7(C2), 67.7( C4), 60.6( C3)。

(2)5的制备(以5a为例)

在反应瓶中加入3a2.1 g(3.2 mmol), 4 0.73 g(1.77 mmol)和无水二氯甲烷45 mL，搅拌至澄清。加入活化4Å分子筛7 g，氮气保护下于-10 ℃慢慢加入AgSO3CF30.82 g(3.19 mmol)的无水甲苯(8 mL)溶液,于室温反应2 h。加入二氯甲烷40 mL，抽滤，旋干滤液得黄色糖浆状粗品，经硅胶柱层析[洗脱剂：A=V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=45 ∶1]分离得3β-O-(2,3,4,6-四-O-苯甲酰-β-D-葡萄糖)-solasodine(A)0.88 g。

在反应瓶中加入A 1.2 g(1.71 mmol)，甲醇15 mL和1 mol·L-1NaOH的甲醇(6.8 mL, 6.8 mmol)溶液，搅拌下于室温反应3 h。旋干溶剂后经硅胶柱层析(洗脱剂:A=10 ∶1)分离得白色固体3β-O-β-D-葡萄糖-solasodine(5a)0.53 g。

用类似的方法合成白色固体5b～5e。

5a： 收率52.4%(以3a计，下同)，m.p.153 ℃～154 ℃；1H NMRδ： 5.34(d, 1H, 6-H), 4.89(d,J=4.8 Hz, 1H, 1′-H), 4.86(dd, 1H, 2′-H), 4.43(t, 1H, 3′-H), 4.22(d, 1H, 4′-H), 3.65(dd, 1H, 6′-Ha), 3.48(m, 1H, 3-H), 3.42(dd, 1H, 6′-Hb), 3.15(m, 1H, 5′-H), 1.23(d, 3H, 21-CH3), 0.98(s, 3H, 19-CH3), 0.87(d, 3H, 27-CH3), 0.76(s, 3H, 18-CH3)；13C NMR(CD3OH)δ: 140.6(C5), 120.9(C6), 101.1(C1′), 98.9(C22), 83.3(C16), 78.3(C2′), 76.6(C3′), 76.4(C4′), 73.3(C3), 70.2(C5′), 61.5(C17), 61.3(C6′), 56.2(C14), 50.1(C9), 45.3(C26), 41.4(C13), 40.7(C12), 38.9(C4), 38.2(C10), 37.1(C1), 36.6(C20), 31.8(C8), 31.6(C15), 31.7(C7), 31.3(C25), 29.2(C23), 28.0(C24), 27.4(C2), 20.4(C11), 18.4(C19), 17.2(C27), 15.1(C18), 13.3(C21)； EI-MSm/z: 575.4(M+)。

5b： 收率77.7%， m.p.185 ℃～187 ℃；1H NMRδ： 5.40(t, 1H, 6-H), 4.73(d,J=4.0 Hz, 1H, 1′-H), 4.67(d, 1H, 2′-H), 4.53(m, 1H, 5′-H), 4.32(d, 1H, 3′-H), 4.17(d, 1H, 4′-H), 3.60(m, 1H, 6′-Ha), 3.50(m, 1H, 3-H), 3.43(m, 1H, 6′-Hb), 1.16(d, 3H, 21-H), 1.08 (s, 3H, 19-H), 1.01(d, 3H, 27-H), 0.86(s, 3H, 18-H)；13C NMR(CD3OH)δ: 140.7(C5), 120.9(C6), 101.7(C1′), 98.9(C22), 83.2(C16), 78.3(C2′), 75.1(C3′), 73.6(C3), 71.2(C4′), 68.9(C5′), 61.5(C17), 61.1(C6′), 56.2(C14), 50.1(C9), 45.3(C26), 41.4(C13), 40.7(C12), 38.9(C4), 38.3(C10), 37.1(C1), 36.6(C20), 31.8(C8), 31.6(C15), 31.7(C7), 31.3(C25), 29.3(C23), 28.1(C24), 27.5(C2), 20.4(C11), 18.4(C19), 17.2(C27), 15.1(C18), 13.3(C21)； EI-MSm/z: 576.0(M++1)。

5c： 收率78.7%， m.p.176 ℃～178 ℃(180 ℃～181 ℃[11])；1H NMR(CD3OH)δ： 5.40(d, 1H, 6-H), 4.86(d, 1H, 1′-H), 3.67(dd, 1H, 2′-H), 3.66(dd, 1H, 3′-H), 3.45(m, 1H, 3-H), 3.38(t, 1H, 4′-H), 3.33(m, 1H, 5′-H), 1.26(d, 3H, 6′-CH3), 1.06(d, 3H, 21-CH3), 0.97(s, 3H, 19-CH3), 0.89(d, 3H, 27-CH3), 0.76(s, 3H, 18-CH3)；13C NMR(CD3OH)δ: 140.4(C5), 121.1(C6), 98.8(C1′), 98.3(C22), 82.9(C16), 72.7(C3), 71.3(C2′), 76.5(C4′), 71.0(C3′), 68.5(C5′), 61.6(C17), 56.2(C14), 50.1(C9), 45.5(C26), 41.4(C13), 40.7(C12), 38.9(C4), 38.2(C10), 37.1(C1), 36.6(C20), 32.0(C8), 31.7(C7), 31.6(C15), 31.2(C25), 29.2(C23), 28.2(C24), 27.7(C2), 20.5(C11), 18.4(C19), 17.3(C27), 16.6(C6′), 15.2(C18), 13.4(C21)； EI-MSm/z: 560.0(M++1)。

5d： 收率66.1%， m.p.184 ℃～185 ℃；1H NMRδ: 8.16～7.48(m, 5H, PhH), 8.57(s, 1H, NH), 5.96(t,J=10.0 Hz, 1H, 4′-H), 5.58(t,J=9.6 Hz, 1H, 3′-H), 5.23(s, 1H, 6-H), 5.10(d,J=8.4 Hz, 1H, 1′-H), 4.22(t,J=8.4 Hz, 1H, 2′-H), 4.22(t, 1H, 5′-H), 4.53(dd, 1H, 6′-Ha), 4.46(dd, 1H, 6′-Hb), 3.47(m, 1H, 3-H), 1.13(d, 3H, 21-CH3), 0.86(s, 3H, 19-CH3), 0.79(d, 3H, 27-CH3), 0.72(s, 3H, 18-CH3)；13C NMR(CD3OH)δ: 169.5(PhCO), 140.5(C5), 121.1(C6), 134.9, 131.2, 128.2, 121.0, 100.0(C1′), 98.4(C22), 81.2(C16), 79.1(C2′), 76.5(C3), 74.4(C3′), 70.9(C4′), 62.1(C6′), 61.5(C5′), 56.9(C17), 56.2(C14), 50.1(C20), 46.3(C9), 46.1(C26), 41.4(C4), 40.5(C12), 39.2(C13), 38.8(C1), 37.0(C8), 36.5(C15), 32.7(C7), 31.7(C2), 31.3(C23), 29.3(C25), 29.0(C24), 20.5(C11), 18.5(C19), 17.9(C18), 15.4(C21), 13.8(C27)； HR-MS： Calcd for C40H58N2O7(M+) 678.424 4, found 678.424 3。

5e： 收率65.9%， m.p.136 ℃～138 ℃；1H NMR(CD3OH)δ： 5.51(s, 1H, 1′-H), 5.39(d, 1H, 6-H), 4.32(m, 1H, 4′-H), 3.86(dd, 1H, 3′-H), 3.82(s, 1H, 2′-H), 3.38(s, 1H, 3-H), 3.53(m, 2H, 5′-Hb, Ha), 1.07(s, 3H, 19-H), 1.06(d, 3H, 21-CH3), 0.92(d, 3H, 27-CH3), 0.86(s, 3H, 18-CH3)；13C NMR(CD3OH)δ： 140.6(C6), 121.0(C5), 101.7(C1′), 98.4(C22), 78.3(C16), 72.9(C3), 71.0(C2′), 68.3(C3′), 65.5(C4′), 62.1(C17), 56.5(C14), 52.2(C5′), 50.2(C9), 46.4(C26), 41.4(C13′), 40.4(C4), 39.3(C12), 38.3(C10), 37.1(C20), 36.6(C15), 31.7(C25), 31.6(C8), 31.3(C7), 29.3(C23), 28.1(C24), 20.5(C11), 18.4(C19), 17.8(C27), 15.3(C18), 13.7(C21)； HR-MS： Calcd for C32H51NO6: 545.371 6(M+), found 545.371 9。

2 结果与讨论

2.1 合成

甾体皂甙的合成方法较多[12]，其中Koenigs-Knorr和Schmidt法最常用。卤代酰化糖和三氯乙酰亚胺酯酰化糖是两个重要中间体,卤代酰化糖制备较成熟容易，为此研究选择Koenigs-Knorr的甙化方法。以苯甲酰氯[n(1) ∶n(酰氯)=1.0 ∶6.1或1.0 ∶5.1]在吡啶或三乙胺作用下制备全苯甲酰化糖2a～2e,反应跟踪及纯化容易;2a～2e与30%溴化氢醋酸溴化剂[n(2) ∶n(溴化剂)=1.0 ∶2.0]反应制备中间体溴代酰化糖3a～3e;在-10 ℃～-5 ℃,无氧无水条件下,无水二氯甲烷和无水甲苯为溶剂,分子筛除水,以等摩尔量的AgSO3CF3催化,3a～3e与4缩合反应2 h～3h,然后在甲醇/甲醇钠作用下脱保护基合成了5a～5e,两步收率约70%。在等摩尔量硝酸银催化下,反应无需氮气保护, 在0 ℃～室温反应4 d～10 d,3a～3e与4缩合反应亦可得到5a～5e,收率52%～73%,反应操作简便容易。

根据1H NMR端位氢的判断规则[13],对3a～3e和5a～5e的甙键构型进行初步分析,1a,1b和1d适合该规则,3a,3b和3d的端位氢3J1,2分别为4.0 Hz, 4.0 Hz和7.2 Hz,因此3a,3b的甙键可确定为α-D构型,而3d为β-D构型。3a,3b和3d与4甙化缩合物端位氢3J1,2分别为8.0 Hz, 7.6 Hz和8.4 Hz,因此它们以及5a, 5b和5d糖甙键确定为β-D构型。5c试验数据与文献[11]相符,糖甙键为α-L构型。另推测5e为β-L构型。

2.2 体外抗肿瘤活性

MTT法： 5a～5e用DMSO溶解后，加入PBS(-)配成1000 μg·mL-1的溶液或均匀的混悬液，然后用含DMSO的PBS(-)稀释。

在96孔板每孔加入4～5×104个/mL的细胞悬液100 μL，置37 ℃， 5%CO2培养箱内。24 h后加入样品液，10 μL/孔，设双复孔，37 ℃， 5%CO2作用72 h。每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，作用4 h后加入溶解液，100 μL/孔，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测570 nm处的OD值，计算IC50,结果见表1。从表1可见，5a～5e具有温和的体外抑制活性,其中5d具有广谱优势的活性。从表1还可见，5a～5e对MAD-MD-435,231, QGY7703和HL-60三种肿瘤细胞有较好的选择性抑制活性;solasodine 3-位羟基上引入非天然的苯甲酰氨基葡萄糖可有效增强solasodine的抗肿瘤活性,对5d的进一步修饰以发现广谱更有效的抗肿瘤化合物的工作正在进行,待后续报道。

表15a～5e的体外抗肿瘤活性*
Table1In vitro antitumor activities of 5a～5e

CompIC50/μg·mL-1ABCDE5a>20>2012.3811.2513.395b>20>20>20>20>205c12.27>207.6911.2211.655d9.9411.555.60(231)13.355.035e>20>2016.19>20>20阿霉素0.1330.0610.0460.0160.001

*4的IC50>20 μg·mL-1； A： A549； B： QGY7703； C： HL-60； D： Colo205； E： MDA-MD-435,231

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