循环MicroRNA:急性心肌梗死的新型标志物

闫 琦， 王文强， 侯 敢， 黄迪南

(广东医学院生物化学与分子生物学教研室，广东湛江524023)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于冠状动脉粥样斑块破裂，冠状动脉急性闭塞导致血流中断，心肌严重持久缺血、缺氧而致坏死。世界卫生组织预测到2020年冠心病将成为人类的第一大杀手。快速、准确地诊断急性心肌梗死并予以及时、有效的治疗对预后至关重要。心肌梗死标志物在AMI诊断中扮演着重要角色，检测方便、快速、准确率高有着其他检测手段不可替代的优势。

一、目前临床应用的AMI标志物

心肌肌钙蛋白(cTn，包括cTnI、cTnT)是主要在心脏表达的结构蛋白，目前临床用其与心电图和肌酸激酶同工酶(CK-MB)相结合来确诊AMI。研究显示 cTn是目前最好的心肌梗死标志物［1-2］，在胸痛发生的4～12 h即可以在血清中检测到，并且和心肌梗死面积直接相关。但是cTn在心肌损伤后缓慢的释放入血液，在AMI发病的前几个小时仍不够敏感，并且需要每6 h检测1次。因此，还需要更早、更高敏感性和特异性的标志物。最近研究显示高灵敏度肌钙蛋白检测方法(hs-cTn)可以早期区分AMI和其他非冠状动脉心脏病，并具有杰出的精确度［3］，是未来AMI标志物的发展方向之一。

二、microRNA(简称miRNA)概述

近年来，miRNA作为新型肿瘤标志物得到了广泛关注［4］。研究发现一些心脏特异的miRNAs在AMI发生后出现在外周血中，也有可能成为新一代的心肌梗死标志物。miRNAs是真核生物细胞中的一类不编码蛋白的小分子RNA，平均长约22个核苷酸，具有高度的保守性、时序性和组织特异性。2012年8月1日，miRBase升级至19.0版(http://www.mirbase.org/)，人类 miRNAs共2 042种，其中大部分在细胞生长和凋亡、血细胞分化、同源异形盒基因调节、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生、胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。心脏中存在200多种miRNA，心肌中最丰富的有miR-1、let-7、miR-133、miR-126-3p、miR-30c 和miR-26a，动脉平滑肌细胞中有miR-145、let-7、miR-125a、miR-125b、miR-23和miR-143。在维持心脏正常功能中也发挥了重要作用，其表达失控和心脏疾病直接相关。

近年研究发现在人体多种体液中也存在着miRNA［5］。血液中有大量的RNA酶，但miRNAs在血浆或血清中却非常稳定地存在，他们被有效保护以避免接触RNase，在严酷环境的条件下仍能保持稳定。Valadi等［6］报道外切酶体中含有miRNA，血清中的miRNAs是受到外切酶体的保护才免于被消化。然而，关于miRNA是怎样被外切酶体包裹及哪些因素引起释放，这些过程中miRNA的功能是否发生变化等问题，还没有合理的解释。Mitchell等［7］将血浆放置在室温中24 h或经过8次反复冻融对miRNAs的量进行测试，发现影响很小，没有明显差异。Chen等［8］发现A549细胞提取物中的大分子RNA，如28S rRNA、GAPDH、18S rRNA、β-actin和U6，能被核糖核酸酶轻易降解，而miRNA能一定程度对抗核糖核酸酶，并且在血清中加入核糖核酸酶也不会造成miRNA的降解。由此证明了血清中miRNA不但可以抵抗酶的消化，而且耐酸耐碱，更不受温度变化及放置时间的影响，比蛋白更适宜作为标志物。

三、miRNA与AMI的早期诊断

van Rooij等［9］用定量聚合酶链反应(PCR)和miRNA芯片检测大鼠心肌梗死模型梗死心肌边缘区和远离区的miRNAs表达情况，发现在心肌梗死后3 d，边缘区有40个miRNAs发生明显变化(以2倍为界)，其中17个上调、23个下调，远离区有22个miRNAs发生明显变化，其中12个上调、10个下调。在心肌梗死后14 d，边缘区有69个miRNAs上调。Alessandra等［10］在结扎小鼠冠状动脉6 h后，发现miR-1和miR-133在结扎部位及其边缘浓度下降，而在外周血液中升高，预示着这些miRNAs释放到了血液中。人类心肌梗死发生后外周血miRNAs水平也发生变化。AMI患者血液中相关的miRNAs的变化以及CKMB和cTnI的表达量见表1。

表1 AMI患者血液中miRNAs与其对比标志物的变化

miRNA和传统蛋白质标志物相比具有以下优势:结构简单、具有低复杂性、组织细胞特异性、无后加工修饰、检测方便等。与现有标志物相比，出现更早，准确率更高。Wang等［13］的研究显示，在出现症状4 h的AMI患者血浆中miR-208的检出率为100%，而 cTnI的检出率只有85%。Devaux等［14］比较了510例AMI患者和87名健康人的血清hs-cTnT和miRNA，发现AMI患者血浆miRNA-208b和miR-499极度升高，而在健康人血清中几乎检测不到，与hs-cTnT相比，miR-499更能提高AMI诊断的准确率。

1.miR-1 miR-1主要在心肌和骨骼肌中表达，分为miR1-1和miR1-2。miR-1参与心脏发育和肌肉分化。Cheng等［12］在体外通过TritohX-100诱导一个心肌坏死模型，发现坏死心肌中的miR-1能够释放到培养基中，并且在24 h内很稳定。继发现miR-1水平在心肌缺血小鼠模型中异常表达后，Ai等［15］用实时定量RT-PCR对93例AMI患者和66名健康人的血浆miR-1水平进行比较，结果显示AMI患者血浆miR-1水平明显升高，并且在2周后恢复正常。Long等［11］用实时逆转录(RT)-PCR来检测AMI患者血浆循环miR-1和miR-126水平，同时用ELISA测定血浆cTnI。结果表明miR-1、miR-126和cTnI的表达水平表现出相同的趋势，预示着miRNAs有可能为新一代的AMI标志物。

2.miR-208 肌球蛋白基因还编码miR-208a和miR-208b，Ji等［16］用基因芯片来检测小鼠组织特异的miRNA，发现miR-208只在心脏中大量表达，具有高度特异性，是最适合作为AMI标志物的miRNA。在小鼠AMI模型中，冠状动脉结扎后1 h血浆miR-208开始增加，3 h达到基线的1 000倍以上，并在24 h回到基础水平［13］。miR-208在健康人外周血中检测不到。Wang等［13］报道miR-1、miR-133a、miR-499 和miR-208a在AMI发生后升高，其中miR-208a表现出了最高的敏感性和特异性。通过对444例AMI患者血浆中miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-208a、miR-208b 和miR-499浓度的测定，并用单变量分析和性别-年龄调整分析，发现miR-208水平与AMI死亡率有明显关系［17］。

3.miR-133 miR-133在平滑肌、骨骼肌和心肌中表达，包括miR-133-a和miR-133-b。miR-133是血管平滑肌表型开关的一个重要调节器，在动脉粥样硬化进展中起了一定作用。在小鼠模型中，miR-133在心肌梗死发生后1 h开始在外周血中出现，3 h达到峰值，比基线高出了1 000倍［13］。同样的结果也出现在人类，Wang 等［18］对51例AMI患者和28名健康人血浆的miRNA水平进行分析，结果表明AMI患者血浆中的miR-133是健康对照组的4.4倍。虽然miR-133在骨骼肌中表达丰富，但是急性肢体缺血不会导致外周血miR-133水平的升高，表明损伤后外周血miRNA升高具有组织特异性［19］。

4.miR-499 miR-499在肌肉中特异表达，在肌球蛋白基因调控中起重要作用。虽然miR-499在心肌中表达丰富，但是在缺血心肌中浓度下降，说明其已从坏死组织中释放到外周血中。在大鼠和小鼠心肌梗死模型中外周血miR-499水平显著升高。Adachi等［20］对 AMI、不稳定性心绞痛、充血性心力衰竭患者和无心脏疾病对照组的血浆miR-499水平进行了评估，结果显示miR-499在所有AMI患者血浆中都升高。此外，Corsten等［21］比较了有不同程度心脏损害的患者血浆中心脏相关的miRNAs(miR-1、miR-133a、miR-208b和miR-499)，发现AMI患者血浆中miR-208b和miR-499与对照组相比有显著升高。关于AMI患者循环miRNAs的研究总结见表2。

表2 AMI患者循环miRNAs的研究总结

四、循环microRNA的检测方法

目前循环miRNA检测方法主要有:miRNA芯片、Northern blot、原位杂交技术、荧光实时定量RTPCR(qRT-PCR)和高通量测序(Illumina/Solexa)。大致可分为两类:一类是单样本检测方法，如Northern blot、原位杂交技术、qRT-PCR。另一类是高通量的检测方法，如高通量测序技术、微阵列芯片技术等能够同时测定多个样本，相对于单样本检测方法，其能快速大规模地检测多个microRNA的表达情况，但此方法所需样本量大，且准确性低，不利于精确定量miRNA。循环miRNA表达与定量检测最常用的方法是qRT-PCR，此方法特异性和灵敏度高，并且操作相对简单。大量实验研究均用此方法进行miRNA的定量检测。qRT-PCR主要是基于茎-环的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)和基于polyA加尾的RT-PCR方法。这2种方法均可以采用Taqman探针或者SYBR荧光染料，前者特异性更高，后者通用性好。Chen等［8］不经过总RNA的提取，直接使用10μL血清进行qRT-PCR分析的结果，与血清提取总RNA后进行qRT-PCR分析的结果一致。这种方法如果能进一步优化将会减少miRNA检测的步骤及成本。也有研究通过miRNA反转录试剂盒反转录成cDNA后进行PCR扩增定量［23］。基因芯片可以同时检测数百个miRNA。在玻璃载体上固定一系列核苷酸捕获探针，然后从样本中抽提总RNA与捕获探针进行杂交。可通过使用锚定核酸的方法(LNAs)来对探针的退火温度进行标准化，适用于临床大规模初步筛查。新一代测序技术在无需任何序列信息的前提下即可进行miRNA表达谱研究，并在此基础上发现和鉴定新的miRNA分子，但是此方法价格偏高。最近，Lusi等［19］发现用电化学基因传感器能够更加简便快速地检测循环体液中的miRNAs，而且敏感度可达0.1 pmol/L。miRNA检测方法的发展进一步为miRNAs成为生物标志物提供了可能。

五、展望

心肌特异的miRNAs:miR-1、miR-133、miR-208和miR-499作为AMI标志物具有在外周血中出现早且稳定、准确率高、结构简单等优势。miRNAs和hs-cTn联合应用于AMI的早期，也许可以提高检出率和准确率。血清miRNAs也许可以列入60岁以上患者入院常规检查项目，以筛查不典型AMI，降低死亡率。Matsumoto等［24］的调查研究发现，miRNAs还可以评估预后，AMI康复的患者血清中miR-155和miR-380水平的升高可以预测1年内的心脏性死亡。miRNAs在临床上的推广应用之前，还有许多问题需要解决:目前的实验所用标本量较小，需要进一步大规模实验证实从AMI发病到miRNAs在外周血中可检测到的最短时间、在外周血中的参考区间、4组标志物在外周血中出现的顺序及联合检测的最佳方案等。Widera等［17］的研究发现不稳定性心绞痛和心肌梗死患者血浆中的miRNAs有大量重叠，如何区分心绞痛和心肌梗死需进一步实验解决。miRNAs新的快速检测技术的开发也非常重要。qRT-PCR虽然有着卓越的敏感性和特异性，但是仍需要2～3 h的检测时间，不利于早期快速确诊和计算梗死面积。另外，目前仍缺乏一套标准化程序，难以保障结果的稳定性。随着研究的深入，miRNAs作为AMI早期诊断标志物值得期待。

［1］Reichlin T，Hochholzer W，Bassetti S，etal.Early diagnosis of myocardial infarction with sensitive cardiac troponin assays［J］.N Engl JMed，2009，361(9):858-867.

［2］Keller T，Zeller T，Peetz D，etal.Sensitive troponin I assay in early diagnosis of acute myocardial infarction［J］.N Engl J Med，2009，361(9):868-877.

［3］Haaf P，Drexler B，Reichlin T，etal.High-sensitivity cardiac troponin in the distinction of acute myocardial infarction from acute cardiac noncoronary artery disease［J］.Circulation，2012，126(1):31-40.

［4］杨中玫，沈 茜.游离microRNA在肿瘤诊断中的临床应用价值［J］.检验医学，2010，25(5):407-410.

［5］Weber JA，Baxter DH，Zhang S，etal.The microRNA spectrum in 12 body fluids［J］.Clin Chem，2010，56(11):1733-1741.

［6］Valadi H，Ekström K，Bossios A，etal.Exosomemediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells［J］.Nat Cell Biol，2007，9(6):654-659.

［7］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，etal.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(30):10513-10518.

［8］Chen X，Ba Y，Ma L，etal.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］.Cell Res，2008，18(10):997-1006.

［9］Van Rooij E，Sutherland LB，Thatcher JE，etal.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(35):13027-13032.

［10］D'Alessandra Y，Devanna P，Limana F，etal.Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction［J］.Eur Heart J，2010，31(22):2765-2773.

［11］Long G，Wang F，Duan Q，etal.Human circulating microRNA-1 and microRNA-126 as potential novel indicators for acute myocardial infarction［J］.Int J Biol Sci，2012，8(6):811-818.

［12］Cheng Y，Tan N，Yang J，etal.A translational study of circulating cell-free microRNA-1 in acute myocardial infarction［J］.Clin Sci(Lond)，2010，119(2):87-95.

［13］Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，etal.Circulating microRNA:a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans［J］.Eur Heart J，2010，31(6):659-666.

［14］Devaux Y，Vausort M，Goretti E，etal.Use of circulating microRNAs to diagnose acute myocardial infarction［J］.Clin Chem，2012，58(3):559-567.

［15］Ai J，Zhang R，Li Y，etal.Circulating microRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391(1):73-77.

［16］Ji X，Takahashi R，Hiura Y，etal.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury［J］.Clin Chem，2009，55(11):1944-1949.

［17］Widera C，Gupta SK，Lorenzen JM，etal.Diagnostic and prognostic impact of six circulating microRNAs in acute coronary syndrome［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，51(5):872-875.

［18］Wang R，Li N，Zhang Y，etal.Circulating microRNAs are promising novel biomarkers of acute myocardial infarction［J］.Intern Med，2011，50(17):1789-1795.

［19］Lusi EA，Passamano M，Guarascio P，etal.Innovative electrochemical approach for an early detection of microRNAs［J］.Anal Chem，2009，81(7):2819-2822.

［20］Adachi T，Nakanishi M，Otsuka Y，etal.Plasma microRNA 499 as a biomarker of acute myocardial infarction［J］.Clin Chem，2010，56(7):1183-1185.

［21］Corsten MF，Dennert R，Jochems S，etal.Circulating MicroRNA-208b and MicroRNA-499 reflect myocardial damage in cardiovascular disease［J］.Circ Cardiovasc Genet，2010，3(6):499-506.

［22］Gidlöf O，Andersson P，van der Pals J，etal.Cardiospecific microRNA plasma levels correlate with troponin and cardiac function in patients with ST elevation myocardial infarction，are selectively dependent on renal elimination，and can be detected in urine samples［J］.Cardiology，2011，118(4):217-226.

［23］Liu J，Gao J，Du Y，etal.Combination of plasma microRNAs with serum CA19-9 for early detection of pancreatic cancer［J］.Int J Cancer，2012，131(3):683-691.

［24］Matsumoto S，Sakata Y，Nakatani D，etal.A subset of circulating microRNAs are predictive for cardiac death after discharge for acute myocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，427(2):280-284.