大强度耐力训练和不同剂量补铁对大鼠血清铁、血红蛋白及骨骼肌线粒体呼吸链功能的影响

李洁 王博

西北师范大学体育学院（兰州730070）

铁参与体内众多生化反应并发挥重要作用，对维持运动能力至关重要。研究表明，大强度运动引起铁缺失甚至缺铁性贫血。机体铁代谢紊乱（铁缺乏）导致蛋白质合成减少，血红蛋白（Hb）携氧能力下降以及能量代谢失调，影响运动员的能量代谢水平，使其运动能力下降［1，2］。营养干预明显改善运动训练引起的铁代谢紊乱［3］。血清铁蛋白（SF）较低的女运动员补铁后，SF和Hb均明显增加［4］。 另有研究表明，缺铁影响大鼠骨骼肌的工作能力，并使骨骼肌线粒体铁硫蛋白（Fe-S）下降［5］，肌红蛋白含量下降40%～60%，细胞色素氧化酶活性及电子传递能力下降50%，而且耐力成绩恢复与组织铁浓度回升密切相关［6］。骨骼肌是评价运动能力重要的靶器官，为了进一步明确铁影响有氧能力的机制，本研究以大鼠骨骼肌细胞为研究对象，施加大强度耐力训练及不同剂量补铁，通过测定大鼠血清铁、血红蛋白含量及骨骼肌线粒体呼吸链酶复合体活性，探讨大强度耐力训练及补铁对机体铁代谢及能量代谢的影响，为合理应用营养补剂提高机体有氧工作能力的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性健康5周龄Wistar大鼠50只，由兰州大学医学院动物实验中心提供，动物生产许可证：SCXK（甘）2005-0007，体重100 g左右，分笼饲养，每笼5只。国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由饮食饮水，室温（23±2）℃，相对湿度（50±10）%，自然采光，饲养室、用具等每周用紫外灯灭菌一次。本实验在西北师范大学体育学院运动人体科学实验中心完成。

1.2 动物适应性训练、筛选及分组

大鼠购入后在动物房饲养2天，以适应环境。然后所有大鼠进行1次/天、共2天的水平跑台适应性运动，跑台速度从10 m/min开始递增到15 m/min，运动时间10 min，使大鼠熟悉跑台。根据体重、跑台运动适应情况，淘汰体重过轻或过重、不适应跑台运动的大鼠，保留40只大鼠进行分组实验。

筛选出的40只大鼠随机分为5组，每组8只：安静对照组（C组）、训练组（T组）、小剂量补铁+训练组（S组）、中剂量补铁+训练组（M组）和大剂量补铁+训练组（L组）。

1.3 训练方案

训练方案参见文献［3，7］。训练大鼠进行速度为30 m/min的水平递增负荷跑台运动，第1～2周每天早上训练1次，运动时间从5 min开始，每次递增2 min。第3～4周每天训练2次（早、晚各1次），每次递增2 min。最后一次运动时间为75 min。第5～8周每天训练2次（早、晚各1次），第5周运动时间为80 min，第6周运动时间为85 min，第7周运动时间以90 min开始、之后以2 min/次进行递增，第8周末运动时间达到136 min，6 d/周（表1）。若训练中大鼠出现严重力竭症状（连续施加机械刺激大鼠不能继续跑动、下跑台后腹部触地严重呈甲鱼状），则允许其休息2～5 min后继续运动。

表1 大鼠跑台运动时间（min）

1.4 补铁及剂量

第5～8周，补铁大鼠灌胃补充硫酸亚铁溶液，1次/d。小剂量为28.85 mg/d/kg，中剂量为57.7 mg/d/kg，大剂量为115.4 mg/d/kg［8］。 每周一称1次体重。

1.5 取样及线粒体制备

训练结束后24 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，由腹主动脉取血。20 μl即刻用于测定Hb含量，其余血样注入离心管，37℃保温30 min，3000 r/min离心15 min，分离血清，放入-20℃低温保存，用于血清铁的测定。取血后，于冰盘上迅速取出股四头肌，在冷生理盐水中除去脂肪等结缔组织后，滤纸吸干，置于液氮中冷冻，-20℃低温保存待用。

将低温保存的骨骼肌样本取出，0～4℃放置融化，在冰浴中将股四头肌剪成碎块，并按重量体积比（1∶5）加入匀浆缓冲液 （缓冲液组成：250 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA，pH 7.4）匀浆。按文献［9］差速离心提取线粒体。将制备的线粒体用 悬 浮 液 （30 mmol/L蔗 糖 、20 mmol/L Tris-HCl、0.1%BSA，pH 7.2）悬浮待用。

1.6 测试指标及方法

按血红蛋白计测定说明测定血红蛋白（Hb）含量。按测试盒操作程序测定血清铁含量。参照Vyatlina等［10］的方法测定线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ（CⅠ～CⅣ）活性。以牛血清白蛋白为标准采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

药品与试剂：2，3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1，4-benzoquinone（DB，CoQ0）、NADH、rotenone（鱼藤酮 ）、Cyt c （ 细 胞 色 素c）、antimycin （ 抗 霉 素 ）、Dodecyl-β-D-maltoside （β-裂解剂）、bovine serum albumin（BSA，牛血清白蛋白）、考马斯亮蓝G250为sigma 公 司 产 品 ，2，6-dichlorophenolindophenol sodium salt hydrate （DCPIP）为Fluka公司产品，血清铁测试盒为南京建成生物工程研究所提供，其余为国产分析纯试剂。

主要仪器：DSPT-202型动物跑台 （中国杭州段氏制作），血红蛋白计（瑞典B-Hemoglobin），YQ-3电动匀浆器 （江苏金坛市仪表仪器厂），UNIVERSAL 32R台式高速冷冻离心机（德国），UV754N紫外分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司）。

1.7 统计学分析

实验数据均用mean±SD表示，组间比较用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，P<0.05时认为具有显著性差异。

2 结果

2.1 血清铁及Hb含量（表2）

与C组相比，T组血清铁含量显著下降19.5%（P<0.01），S组血清铁含量无显著性变化，M组和L组血清铁含量均显著升高，分别升高19.3%（P<0.05）和34%（P<0.01）。 与T组相比，S组、M组和L组血清铁含量均显著升高（P<0.01），分别升高41.2%、47.9%和66.6%。

与C组相比，T组Hb含量显著下降14.3%（P<0.01），S组、M组和L组均无显著性变化。与T组相比，S组、M组和L组Hb含量均显著升高（P<0.01），分别升高9.8%、27.2%和15.8%。

表2 各组大鼠血清铁及Hb含量比较

2.2 骨骼肌线粒体呼吸链CⅠ～CⅣ活性（表3）

与C组相比，T组、S组、M组和L组骨骼肌线粒体呼吸链CⅠ活性均显著升高 （P<0.01），分别提高115.8%、50.5%、150.53%和39.43%，T组、S组和M组CⅡ活性均显著升高 （P<0.01），分别提高82.11%、72.23%和133.38%，L组无显著性变化；T组、S组、M组和L组骨骼肌线粒体呼吸链CⅢ活性均显著提高（P<0.01），分别提高35.73%、165.9%、161.91%和36.75%；M组骨骼肌线粒体呼吸链CⅣ活性显著提高43.07%（P<0.01），T组、S组和L组显著下降（P<0.01），分别下降7.65%、37.52%和10.22%。

与T组相比，M组骨骼肌线粒体呼吸链CⅠ活性显著提高16.09%（P<0.01），S组和L组均显著下降（P<0.01），分别下降30.26%和35.39%；M组骨骼肌线粒体呼吸链CⅡ活性显著提高28.15%（P<0.01），S组和L组均显著下降 （P<0.01），分别下降5.43%和46.7%；S组和M组骨骼肌线粒体呼吸链CⅢ活性均显著提高（P<0.01），分别提高95.9和92.96%，L组无显著变化。M组骨骼肌线粒体呼吸链CⅣ活性显著提高54.92%（P<0.01），S组和L组均显著下降（P<0.01），分别下降32.34%和2.78%。

表3 各组大鼠骨骼肌线粒体呼吸链CⅠ～CⅣ活性比较（活性单位：nmol/min/mg protein）

3 讨论

3.1 运动训练及补铁对大鼠血清铁含量的影响

研究显示，长期递增负荷跑台运动导致大鼠血清铁呈降低趋势，营养干预后血清铁显著升高［3］。本研究结果显示，大强度递增负荷耐力训练大鼠血清铁显著降低，补铁+训练组血清铁含量均显著高于训练大鼠。上述提示运动训练造成机体血清铁含量低下，营养干预后改善血清铁含量。

3.2 运动训练及补铁对大鼠Hb含量的影响

有研究显示，大运动量跑台运动训练后，Hb含量显著低于对照组［11，12］。 本研究结果显示，训练组大鼠Hb含量显著低于安静对照组。这说明大强度耐力训练引起机体铁缺失甚至缺铁性贫血。其机制可能为，大强度耐力训练引起红细胞破坏增加，铁丢失增加，导致红细胞数下降和血红蛋白浓度降低，是机体对大负荷量运动训练的一种生理应答。

本研究结果还显示，大强度耐力训练期间适时补铁提高Hb含量，且效应为中剂量补铁大于大剂量补铁大于小剂量补铁。说明大强度耐力训练复合补铁改善运动性贫血状况，中剂量补铁效应最佳。其可能机制是，大强度耐力训练使机体铁代谢紊乱，血清铁含量低下，骨髓红细胞生成速度相对低于红细胞的破碎速度，致使Hb含量降低；补铁缓解了运动训练对铁代谢的不利影响，提高红细胞生成速度和Hb含量，从而改善机体运氧能力。

3.3 运动训练及补铁对大鼠骨骼肌线粒体呼吸链酶复合体活性的影响

人体细胞95%ATP由线粒体呼吸链所产生。呼吸链主要由NADH-Q还原酶（CⅠ）、琥珀酸-Q还原酶（CⅡ）、细胞色素还原酶（CⅢ）和细胞色素氧化酶（CⅣ）四部分组成。CⅠ辅基有黄素单核苷酸（FMN）和Fe-S蛋白。CⅡ辅基有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、Fe-S蛋白和细胞色素b（Heme b）。CⅢ辅基有Heme b562、Heme b566、Heme c1和 Fe-S蛋 白 。 CⅣ 辅 基 有Heme a、Heme a3、CuA和CuB。 这些辅基都是电子载体，电子传递通过与酶分子结合的辅基完成。可见铁在电子传递过程中起重要作用，铁缺乏影响CⅠ～CⅣ活性及ATP生成，影响运动能力。

有研究表明，大鼠力竭性游泳后股四头肌线粒体细胞色素c氧化酶活性显著下降，丙二醛（MDA）含量显著升高，提示机体内源自由基浓度升高和脂质过氧化水平显著升高［13］，一次性力竭运动后，大鼠骨骼肌线粒体内膜NADH-CoQ还原酶和ATP酶活性分别较安静时下降34.2%和46.2%［14］，提示力竭运动导致骨骼肌线粒体呼吸链功能下降。本研究结果显示，训练组大鼠骨骼肌线粒体呼吸链CⅠ～CⅢ活性显著高于对照组，CⅣ活性显著低于对照组。运动训练使骨骼肌线粒体对训练刺激产生了一定适应，为适应机体运动的需要，增加骨骼肌线粒体呼吸链还原酶CⅠ～CⅢ活性。运动训练提高了线粒体耗氧量，氧自由基产生增多，过氧化脂质含量增高，损伤呼吸链氧化酶CⅣ，使其活性下降。分子氧可在电子传递链中途接受一个单电子，即氧的单电子还原生成超氧阴离子（O2·-），对CⅣ活性产生影响且具有损害性，最终影响ATP生成［15］。 此外，在能量代谢过程中，是否由于氧化还原势能改变和膜表面正电效应，造成电子传递的阻力增加［16］，从而使处于线粒体呼吸链末端的CⅣ活性下降？其机制有待进一步研究。

本研究结果还显示，小剂量补铁+训练组大鼠骨骼肌线粒体呼吸链CⅠ～Ⅲ活性显著高于对照组，CⅣ活性显著低于对照组，中剂量补铁+训练组大鼠骨骼肌线粒体呼吸链CⅠ～CⅣ活性显著高于对照组；大剂量补铁+训练组大鼠CⅠ和CⅢ活性显著高于对照组，CⅡ活性无显著变化，CⅣ活性显著低于对照组。这表明运动训练联合补铁可保持或提高骨骼肌线粒体还原酶CⅠ～CⅢ活性，中剂量补铁提高线粒体氧化酶CⅣ活性。大强度耐力训练导致机体铁代谢紊乱，影响Hb和肌红蛋白载氧功能、铁相关酶活性、线粒体呼吸链电子传递过程及质子泵出过程，进而影响机体能量供应。补铁改善机体铁代谢，进而改善机体氧运输功能、线粒体呼吸链电子传递过程及利用氧的能力。另外，本研究结果还显示，运动训练期间联合中剂量补铁提高骨骼肌线粒体呼吸链CⅠ～CⅣ活性，效果优于小剂量和大剂量补铁。这可能与小剂量的剂量不够、大剂量导致机体铁过载有关。这提示铁在维持线粒体呼吸链功能时可能存在临界水平。

4 总结

大强度耐力训练引起大鼠缺铁性贫血，训练期间联合补铁改善运动性贫血，中剂量补铁提高骨骼肌线粒体呼吸链功能效果好于小剂量和大剂量补铁。

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