不同痰标本处理方法对结核分枝杆菌罗氏培养检测结果的影响

赵立平 朱玛 姜广路 于霞 黄海荣

目前，结核病仍然是全球范围内严重的公共卫生问题之一［1］。据 WHO统计，2002年世界1／3的人口已感染结核分枝杆菌［2］，据估算，每年约有200万例患者死于结核病［3］。结核病的早期诊断和快速治疗对疾病的控制至关重要，诊断的延误必然导致病情恶化，并增加结核病传播的风险［4］。结核分枝杆菌培养是结核病细菌学检查的重要方法，被认为是诊断结核病的金标准。目前在我国各级结核病诊断实验室中，基于罗氏培养基的固体培养是最常用的培养方法之一。本研究分析采用简单法和离心法处理痰标本，以及采用离心法处理痰标本时不同离心条件对罗氏培养检测结果的影响，以寻求目前情况下最适合我国结核病实验室操作的技术。

材料和方法

一、临床标本的来源

选取2010年9月至2010年11月在北京市结核病胸部肿瘤研究所国家结核病临床实验室进行细菌学检查的疑似结核病患者痰标本198份，其中显微镜检查涂片阳性者99份，涂片阴性者99份；男143例，女55例。年龄范围10～91岁，平均年龄（48．4±19．9）岁。

二、方法

1．仪器和试剂：恒温培养箱（型号：SKP08B，黄石市恒丰医疗器械有限公司）；涡旋振荡器（型号：vortex-2，Scientific Industries）；摇床 （型号：培英HZ-E，太仓市实验设备厂）；离心机（型号：CR21GⅢ，HITACHI）；氢氧化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、谷氨酸钠、枸橼酸镁均购自国药集团化学试剂有限公司。

2．罗氏培养基的制备：酸性罗氏培养基和中性罗氏培养基的制备参见参考文献［5］。

3．罗氏培养基简单法培养：取1ml痰标本，加入1～1．5倍体积4%NaOH溶液进行消化，旋紧盖子，在涡旋振荡器上涡旋振荡10～20s，振荡混匀后室温孵育15min。100μl处理后的样品直接接种至酸性罗氏培养基斜面上，每份标本平行接种2管酸性罗氏培养基。37℃温箱培养8周，每周观察记录结果。

4．罗氏培养基离心法培养：取1ml痰标本，加入1～1．5倍体积 N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠（NaOH-NAC）混合溶液进行消化，旋紧盖子，在涡旋振荡器上涡旋振荡10～20s，直至痰标本充分液化；将离心管室温静置15min；加入PBS中和至体积为40ml，分别采用5种不同的离心条件：①3000×g离心15min（一般常规所用离心条件）；②3000×g离心8min；③3000×g离心25min；④2000×g离心15min；⑤5000×g离心15min。100μl处理后的样品分别接种至中性罗氏培养基斜面上。每份标本平行接种2管中性罗氏培养基。37℃温箱培养至8周，每周观察记录结果。

5．结果判定：（1）初生长时间的判定：首次发现培养基斜面上有菌落生长的时间确定为初生长时间。（2）污染率的判定：以标本的份数为计算单位，同一份标本的2个接种管均污染时认为污染，若只有单只接种管污染则不认为污染。污染率＝污染份数／样本数×100%。

6．质量控制（简称“质控”）：质控菌株 H37Rv（ATCC 27294）为国家结核病临床实验室保存菌株，将生长至对数期的H37Rv菌株用生理盐水比浊至0．5个麦氏浓度，取1ml比浊好的菌液，处理方法同痰标本，分别接种100μl至中性或酸性罗氏培养基。若质控菌株培养结果为阳性，说明质控合格，否则质控结果不合格。

7．统计学分析：采用SPSS 13．0统计软件进行分析，计数资料采用卡方检验进行分析，非正态分布的计量资料采用秩和检验进行分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．不同处理方法的培养结果和污染率：任何一种方法培养阳性即认定标本培养阳性，198份痰标本中共有126份培养阳性，其中97份来自涂片阳性痰标本，29份来自涂片阴性痰标本。126份培养阳性的痰标本中，简单法的培养阳性率93．65%（118／126），与一般常规所用离心条件（3000×g离心15min）培养阳性率96．03%（121／126）相比，两者差异无统计学意义（χ2＝0．146，P＝0．702）。在125份离心法培养阳性的标本中，3000×g离心15min、3000×g离心8min、3000×g离心25min、2000×g离心15min、5000×g离心15min 5种不同离心条件下培养阳性率分 别 为 96．03%、89．68%、95．24%、92．06% 和96．03%（表1）。选取的198份痰标本中，简单法总体污染率为3．03%（6／198），离心法3000×g离心15min的污染率为3．54%（7／198），两者间差异无统计学意义（χ2＝0．074，P＝0．785）。

2．不同处理方法的培养结果初生长时间：由于6组不同处理方法的初生长时间数据为非正态分布（Kolmogorov-Smirnow正态性检验结果，P值均＜0．05），故采用秩和检验来进行统计分析。6种不同处理方法初生长时间的差异有统计学意义（χ2＝187．63，P＜0．001）。再进行组内两两比较，将α值矫正为0．0033（0．05／15）。简单法（118份阳性）与一般常规所用离心条件3000×g离心15min（121份阳性）的初生长时间之间的差异有统计学意义（Z＝-4．81，P＜0．001）。5种不同离心条件下初生长时间差异有统计学意义（χ2＝118．73，P＜0．001）。其余4种离心条件下的初生长时间与简单法的比较结果如表2所示。

表1 标本不同处理方法处理后的罗氏培养结果

表2 标本不同处理方法处理后的结核分枝杆菌初生长时间

讨 论

结核分枝杆菌的病原学检查是结核病临床诊断的最重要的依据［6］。目前我国结核病诊断实验室仍以痰涂片显微镜检查和分枝杆菌罗氏培养最为常用。痰涂片显微镜检查虽简单、快速，但敏感度较低，痰涂片检查阳性只能说明痰中含有抗酸杆菌，不能区分死菌与活菌。结核分枝杆菌的培养相对于涂片显微镜检查具有较高敏感度，目前仍然作为结核病诊断的金标准，并且结核分枝杆菌培养还是后续开展的药物敏感度试验、分枝杆菌菌种鉴定、基因分型，以及各种基础研究的前提。培养的优势还体现在，能够针对各种临床标本进行检测，包括痰液、胸、腹腔积液、脑脊液、尿液和脓液等。基于以上原因，结核分枝杆菌培养技术在未来仍将作为一项重要的诊断技术，所以，对这项传统技术的全面评价，并着力于提高技术的诊断效率，仍然有很大的现实意义。

罗氏培养中离心法是先对临床标本进行相应的离心等技术处理，以便对其中的细菌进行沉淀浓缩，从理论上讲可提高标本培养的阳性率。den Hertog等［7］发现不恰当的离心（转速过低或是时间过短）均会导致培养阳性率的降低，同时认为离心的最低条件为3200×g离心22min，但该实验缺少临床标本的数据支持。本研究首次就临床标本在不同离心条件对离心法培养的影响进行比较，结果发现不同离心条件下结核分枝杆菌的初生长时间的差异有统计学意义（χ2＝118．73，P＜0．001），离心力或离心时间降低均会导致初生长时间延长。但不同离心条件下，阳性率有明显差别，3000×g离心15min、3000×g离心8min、3000×g离心25min、2000×g离心15min、5000×g离心15min，5种不同离心条件下培养 阳 性 率 分 别 为 96．03%、89．68%、95．24%、92．06%、96．03%。由此可知当离心力或是离心时间降低均对阳性率有影响。

离心法3000×g离心15min和简单法在初生长时间的差异有统计学意义（Z＝-4．81，P＜0．001），且简单法的平均生长时间比离心法要短2d。简单法总体污染率为3．03%（6／198），离心法3000×g离心15min的污染率为3．54%（7／198）。

综上所述，罗氏培养过程中，简单法检出阳性率与离心法接近，但简单法操作相对简单、污染率较低，初生长时间也相对较短，因而可能更符合临床的需要；应用离心法进行罗氏培养时，无论是离心力或是离心时间的变化对培养的阳性检出率均有影响。

［1］World Health Organization． Global tuberculosis control，WHO report 2002．Geneva：World Health Organization，2002．

［2］Sudre P，ten Dam G，Kochi A．Tuberculosis：aglobal overview of the situation today．Bull World Health Organ，1992，70（2）：149-159．

［3］Frieden TR，Sterling TR，Munsiff SS，et al．Tuberculosis．Lancet，2003，362（9387）：887-899．

［4］Sreeramareddy CT，Panduru KV，Menten J，et al．Time delays in diagnosis of pulmonary tuberculosis：a systematic review of literature．BMC Infect Dis，2009，9：91．

［5］World Health Organization．Laboratory services in tuberculosis control．Part III：Culture．Geneva：World Health Organization，1998．

［6］马玙，朱莉贞，潘毓萱．结核病．北京：人民卫生出版社，2006：104-109．

［7］den Hertog AL，Klatser PR，Anthony RM．Buoyant density of Mycobacterium tuberculosis：implications for sputum processing．Int J Tuberc Lung Dis，2009，13（4）：466-471．