胆型螺杆菌的分离及鉴定

H.bilis是1995年Fox JG等从小鼠的结肠中分离出的新型肠肝螺杆菌属［1］。H.bilis主要定植在小鼠的肝胆系统，也可下行至小鼠的结肠。研究表明，H.bilis感染与胆石症及胆囊癌的发生相关。目前国内关于H.bilis的研究甚少，其致病性及在中国的流行病学特征尚不明确，本课题组成功分离H.bilis，为进一步研究其致病性及制备相应高特异性抗体检测国人及实验动物感染情况奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物来源 无特殊病原体（Specific pathogen free，SPF）的BALB/c小鼠，6～8周龄，购自南方医科大学动物中心。

1.1.2 细菌培养基 空肠弯曲菌选择性琼脂基础（购于上海腹泻病防治中心），脱纤维羊血，抗生素（万古霉素，多粘菌素B，二性霉素B，TMP）。

1.1.3 细菌生化鉴定试剂 由广东环凯微生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物处理 取健康BALB/c小鼠处死后，留取肠组织，布氏肉汤保种液－80℃保存。

1.2.2 细菌培养 组织匀浆后均匀涂布于空肠弯曲菌选择性琼脂基础，添加5%～10%冻融脱纤维羊血，及选择性抗生素万古霉素10mg/L、多粘菌素B 2 500U/L、二性霉素B 10mg/L，TMP 5mg/L，微需氧条件下 （如5%O2、10%的CO2及85%的N2）37℃培养5～7d，挑选可疑菌落传代培养。

1.2.3 形态鉴定 可疑细菌涂片革兰染色，油镜下观察细菌形态。

1.2.4 生化鉴定 可疑细菌行快速尿素酶、氧化酶、过氧化物酶及硝酸还原酶实验（检测试剂盒由环凯生化公司提供），具体参见操作说明。

1.2.5 扫描电镜 PBS缓冲液反复离心洗净细菌后，用戊二醛悬浮固定12～16h，PBS调整浓度至108cfu/mL，取10μL菌液滴加至干净固相支持物（载玻片）乙醇逐级脱水，干燥后金属镀膜观察。

1.2.6 16SrRNA及23SrRNA基因测序 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。以可疑菌基因组DNA为模板，分别采用螺杆菌属特异性 引 物 B38 5′－CTATGACGGGTATCCGGC－3′B39 5′－CTCACGACACGAGCTGAC－3′。

根据已知基因序列的23SrRNA基因的同源性比较及23SrRNA基因的保守序列分布，设计并选取四对扩增23SrRNA基因的通用引物：Primer 1.5－ATTTCCGAATGGGGCAAC －3，3－CTTGTTCGCTATCGGTGTGA －5；Primer 2.5－TCACACCGATAGCGAACAAG －3，3－TCAACTTGGCCATGGATAGA －5；Primer 3.5－TCTATCCATGGCCAAGTTGA －3，3－CCCGACTAACCCTACGATGA －5；Primer 4.5－CGTAGGGTTAGTCGGGTCCT －3，3－TCTCATCTACCTGTGTCGGTTT－5，行PCR扩增。反应条件为94℃10 min总变性，94℃30s，54℃30s，72℃55s，共35个循环，72℃10min总延伸。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳条件80V，30min。阳性结果测序分析（测序工作由英俊生物公司完成）。

2 结 果

2.1 菌落形态 5～7d后空肠弯曲菌血平板上可见针尖样0.1～1mm左右的透明或半透明湿润雾状菌落。

2.2 生化鉴定 该菌尿素酶，氧化酶及过氧化氢酶阳性，硝酸还原试验阴性，42℃不能生长，1.5%氯化钠，1% 甘氨酸可生长，能水解醋酸吲哚酚，不能水解马尿酸盐。而对照的H.pylori标准株ATCC11637，尿素酶，氧化酶及过氧化氢酶阳性，硝酸还原试验阳性，1% 甘氨酸不能生长。

2.3 光镜观察 涂片革兰染色阴性，油镜观察示不规则的“S”，“C”型细小形态，与H.pylori镜下相似。但菌体更细长，螺旋也较多。（如图1）

2.4 扫描电镜 10 000倍放大，见细菌长1.5～5.0mm，宽0.2～0.3mm，形态似不规则的“S”，“W”，“C”，两极稍尖，菌体两极有单根鞭毛。（如图2）

图1 H.bilis革兰染色阴性Fig.1 H.bilis Gram’s negative stain

图2 H.bilis扫描电镜图片Fig.2 Scanning electron micrograph of H.bilis

图3 螺杆菌属特异性引物PCR扩增螺杆菌16SrRNA基因Fig.3 PCR amplification of Helicobacter spp.gene

2.5 16srRNA基因测序 扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，于780bp见明显阳性条带（图3），产物测序结果与GenBank库中基因组同源性对比，结果与Helicobacter bilisATCC43879同源性达到99%（图4）。

2.6 23srRNA基因测序 同样，分4段：366bp、443bp、664和305，除了重复的，共1 717bp，结果与Helicobacter bilisATCC43879同源性达到99%。证实本实验所分离的细菌即为胆型螺杆菌（图5）。

图4 胆型螺杆菌16srRNA基因的一段测序结果Fig.4 Sequencing of 16srRNA gene of H.bilis

3 讨 论

近年来越来越多的螺杆菌属其他成员不断被分离发现，几乎所有的螺杆菌都能够定植在胃肠道，根据它们的寄居主要部位不同，还将螺杆菌分为两大亚类：胃内螺杆菌及肝肠螺杆菌（enterohepaticHelicobacterspecies，EHS）。

H.bilis主要定植在小鼠的肝胆系统，也可下行至小鼠的结肠。研究表明，H.bilis感染与胆石症及胆囊癌的发生相关。众所周知，胆石症患者胆囊癌的发病率是非胆石症者的2.4～10倍，但即使在胆石症患者中，也只有少部分人发生胆囊癌，可见除了胆石症外，还有其他协同因素共同促进胆囊癌的发生，这些因素包括遗传因素、地理和环境因素等。于泰国和日本进行的研究采用PCR技术检测胆囊癌和肝胆系统良性病变患者的组织感染该菌的情况，结果显示胆囊癌患者感染率明显高于胆囊良性病变患者［2］。Satoru Takayama等人进一步研究其致癌机制，将H.bilis与胆囊癌细胞株HuCCT－1共同孵育一定时间后，采用双荧光素梅报告系统检测 NF－KB，E2转录因子（E2transcription factor，E2F）及环磷腺苷反应元件（cyclic AMP response element，CRE）的活性，同时检测培养上清中血管内皮生长因子VEGF的浓度，结果显示NF－KB，E2F及CRE的活性较对照组明显增强，培养上清中的VEGF浓度也较对照组升高。说明H.bilis可能通过激活转录因子如NF－KB，促进VEGF的分泌而促进血管发生，进而促进肿瘤的生成［3］。

H.bilis感染人或动物能引起慢性活动性肝炎，结肠炎，甚至肿瘤形成。在存在胰胆管合流异常的患者中，由于反流的存在，H.bilis的感染比正常人出现更早，最早可婴儿期就出现，大大增加了患者胆系肿瘤发生的危险性［4］。有研究显示，H.bilis可打破免疫平衡，激活炎症细胞，增加宿主对外源性感染的敏感性［5］，在溃疡性结肠炎的患者中，螺杆菌属的检出率都非常高，且PCR测序结果与H.bilis的符合率为100%［6］。慢性肝病的患者，除了自身免疫性肝炎以外，H.bilis的抗体水平都较正常人 显著升高［7］。H.bilis和其他螺杆菌属之间有一定的抗原交叉反应，这对H.bilis的诊断造成一定的困扰，寻找特异性的H.bilis抗原有助于对H.bilis感染的病因学诊断［8］。目前国内关于H.bilis的研究甚少，其致病性及在中国的流行病学特征尚不明确，本课题组成功分离H.bilis，为进一步研究其致病性及制备相应高特异性抗体检测国人及实验动物感染情况奠定了基础。

图5 胆型螺杆菌23srRNA基因的一段测序结果Fig.5 Sequencing of 23srRNA gene of H.bilis

［1］Fox JG，Dewhirst FE，Tully JG.Helicobacter hepaticussp.nov.，a microaerophilic bacterium isolated from livers and intestinal mucosal scrapings from mice［J］.J Clin Microbiol，1994，32（5）：1238－1245.

［2］Matsukura N，Yokomuro S，Yamada S，et al.Association betweenHelicobacter bilisin bile and biliary tract malignancies：H.bilisin bile from Japanese and Thai patients with benign and malignant diseases in the biliary tract［J］.Jpn J Cancer Res，2002，93（7）：842－847.

［3］Takayama S，Takahashi H，Matsuo Y，et al.Effect ofHelicobacter bilisinfection on human bile duct cancer cells［J］.Dig Dis Sci，2010，55（7）：1905－1910.DOI：10.1007/s10620－009－0946－6

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［5］Liu Z，Ramer－Tait AE，Henderson AL，et al.Helicobacter biliscolonization enhances susceptibility to Typhlocolitis following an inflammatory trigger［J］.Dig Dis Sci，2011，56（10）：2838－2848.DOI：10.1007/s10620－011－1701－3

［6］Hansen R，Thomson JM，Fox JG，et al.CouldHelicobacterorganisms cause inflammatory bowel disease［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2011，61（1）：1－14.DOI：10.1111/j.1574－695X.2010.00744.x

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［8］Pisani P，Whary MT，Nilsson I，et al.Cross－reactivity between immune responses toHelicobacter bilisandHelicobacter pyloriin a population in Thailand at high risk of developing cholangiocarcinoma［J］.Clin Vaccine Immunol，2008，15（9）：1363－1368.DOI：10.1128/CVI.00132－08