参与小RNA病毒感染和复制的宿主及病毒蛋白功能研究进展

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小RNA病毒是自然界中普遍存在的一大类动物病毒。该病毒科的某些成员因严重影响着人类的健康而被人熟知。小RNA病毒科包括5个属，分别是肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口蹄疫病毒属和肝病毒属。小RNA病毒是二十面体、单股正链，基因组约7 500个核苷酸的RNA病毒，同时其基因组包括一个65～100nt的3′poly（A）尾。基因组RNA 5′端连接有病毒编码的多肽VPg，因VPg在细胞内被快速降解，因此大多数病毒转录本缺少VPg。小RNA病毒基因组没有帽子结构（m7GpppN）。病毒RNA编码一个大的多聚前蛋白，然后由病毒编码的蛋白酶的加工后变为成熟的病毒蛋白。其中的4种（VP1－VP4）组成病毒的衣壳蛋白，其余蛋白参与病毒的复制。

小RNA病毒对细胞的感染是个高效、多效应的过程。为了完成病毒的整个生命周期，病毒蛋白参与了病毒的复制、翻译，同时改变了宿主细胞的功能，如细胞中的基因表达，蛋白质的定位，信号转导，膜的重排。本文着重综述了小RNA病毒感染和复制过程中参与的病毒蛋白和宿主蛋白的功能。

1 受体结合过程中参与的衣壳蛋白和宿主蛋白

小RNA病毒基因组P1区编码病毒的衣壳蛋白，整个核衣壳由60个P1区编码多肽的四聚体（VP1－VP4）组成。前3个病毒衣壳蛋白（VP1－VP3）定位在病毒衣壳的外表面，而短的VP4则完全定位在病毒衣壳的内表面。病毒衣壳蛋白通过与宿主细胞膜上的受体结合介导最初的感染。许多小RNA病毒有着类似的受体分子，它们属于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF），IgSF的胞外区由2～5个带有氨基末端的免疫球蛋白样区组成。例如，柯萨奇病毒B1－B6受体（coxsackievirus－adenovirus receptor，CAR）有 2 个氨基末端区［1］。在这些受体中，氨基末端区即D1区与小RNA病毒上的“峡谷”的保守氨基酸结合，而触发病毒的不稳定和脱衣壳。因此，一个单一的受体足以使病毒入侵细胞，尤其对脊髓灰质炎病毒（poliovirus，PV）和鼻病毒（rhinovirus，HRV）而言。然而，一些病毒可利用非IgSF细胞表面受体去结合“峡谷”的外表面。例如，某些HRV可利用低密度脂蛋白受体［2］，人类血小板糖蛋白配体－1和清道夫受体B2都是肠病毒71（enterovirus 71，EV71）的细胞受体［3］。口蹄疫病毒可与整联蛋白αvβ3或硫酸乙酰肝素结合，因细胞系和病毒毒株不同而各异。但这些相互作用不会引起病毒粒子的不稳定和脱衣壳，而是可能导致其他受体的聚集或触发随后的胞吞。例如，柯萨奇病毒B3（Coxsackievirus B3，CVB3）通过与第二级受体DAF（decay－accelerating factor，DAF）结合而募集CAR到病毒入侵位点，而DAF是一种在上皮细胞中表达的受体［4］。柯萨奇病毒A21只有辅助受体ICAM－1（intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1）存在的情况下才能与DAF结合而入侵细胞。因此，受体识别在决定病毒对细胞的趋向性和宿主范围方面至关重要。然而，宿主细胞内的蛋白与病毒衣壳蛋白间的相互作用同样很重要。例如，CVB3VP2可能特异地结合到凋亡前体蛋白Siva，影响细胞凋亡的诱导、病毒的扩散和该病毒导致的病理学进程。可与DAF结合的CVB3进入极化的肠上皮细胞需要利用caveolin蛋白来完成内吞作用。肠道病毒属中的艾柯病毒7（Echovirus 7）通过clathrin蛋白介导的内化作用进入感染细胞，接着病毒粒子先后被早期核内体和晚期核内体运输，直至基因组RNA被释放。核内体的成熟需要Rab5蛋白和Rab7蛋白的参与［5］。

2 病毒RNA复制时参与的病毒蛋白和宿主细胞蛋白

小RNA病毒的感染可诱导宿主细胞膜的渗透性和膜结构成分的改变，这些改变是病毒复制过程所必需。已经证明，病毒复制复合物与病毒诱导的膜泡紧密相关，该复制复合物主要包括各种与复制相关的病毒蛋白和宿主细胞蛋白（见表1）。

表1 参与小RNA病毒RNA复制的细胞蛋白Tab.1 Cellular proteins involved in picornavirus RNA replication

2.1 2B蛋白和2BC蛋白 在感染的细胞中，病毒蛋白2B及其前体2BC影响着细胞膜的改变［6］。COPII蛋白在病毒诱导细胞生成囊泡产物中发挥作用。2B和2BC蛋白包含2个疏水区，该疏水区由α两性分子α－螺旋功能域组成，这种功能域在多聚化，整合进宿主细胞高尔基体和内质网膜上起着重要作用，从而产生病毒诱导的囊泡，形成孔蛋白复合物［7］。2B或2BC蛋白在高尔基体上的累积改变了浆膜的渗透性，引起高尔基体复合物的降解，最终导致细胞的裂解。融合2B/2BC复合物的细胞器外膜增加了Ca2＋的流失，致使内质网和高尔基体中的Ca2＋含量减少［8］。2B/2BC复合物导致的Ca2＋稳态失衡是阻断蛋白质从内质网到高尔基体运输的机制之一［9］。2B诱导的细胞内Ca2＋失衡同时与其抗细胞凋亡特性紧密相关。有报道称甲型肝炎病毒2B蛋白可以通过阻断干扰素调节因子－3（Interferon Regulatory Factor 3，IRF－3）的活化来抑制细胞内的干扰素－β基因的转录，这一机制被认为对病毒的生存至关重要［10］。

2.2 3A蛋白、3AB蛋白和3B蛋白 3A蛋白为膜结合蛋白，在病毒感染过程中抑制细胞蛋白分泌和调节膜蛋白递呈时发挥重要作用。CVB3 3A蛋白在细胞内的表达可以扰乱内质网与高尔基体之间的正常物质交换。此外，3A蛋白引起的蛋白运输的紊乱，究其原因是Arf（ADP－ribosylation factor）家族蛋白的再分布。Arf家族蛋白是膜分泌途径的重要成员［11］。Arf蛋白在有活性的GTP结合形式和无活性的GDP结合形式之间转换的周期过程中受鸟嘌呤核苷转换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）和 Arf GTP酶－活化蛋白（Arf GTPase－activating proteins，GAPs）调节［12］。真菌的代谢物——布雷菲尔得菌素（Brefeldin A，BFA）可通过抑制从Arf－GDP到Arf－GTP的再生来阻断细胞中由内质网到高尔基体的蛋白运输。同时BFA可以抑制PV的复制，由此我们能够推测出Arf蛋白参与了病毒RNA的复制。3A蛋白和3CD蛋白可分别通过不同的机制募集Arfs蛋白结合到膜表面［13］。表达的3A蛋白募集Arfs结合到膜上，其方式是通过特异地募集细胞GEF和高尔基体特异的BFA抗性因子1（Golgi－specific brefeldin A resistance factor 1，GBF1）而实现［14］。然而，表达的3CD蛋白可导致其他的GEFs，即BFA抑制鸟嘌呤核苷转换因子1（Brefeldin A－inhibited guanine nucleotide－exchange protein 1，BIG1）和 BIG2结合到膜上［15］。PV、CVB3等许多种小RNA病毒3A蛋白利用高尔基体接头蛋白acyl coenzyme A （acyl－CoA）binding domain protein 3（ACBD3/GPC60）来募集 Phosphatidylinositol 4－kinase class III beta（PI4KIIIβ）蛋白，从而参与小 RNA 病毒的复制［16］。

3AB蛋白是一个多功能蛋白。3A蛋白的疏水区与膜上的囊泡密切联系。这种相互作用被认为是锚定病毒复制复合体到病毒诱导生成的囊泡［17］。体外实验时，重组的3AB蛋白可以与PV 3D蛋白和3CD蛋白相互作用［18］。在PV基因组的四叶草状RNA上，膜相关蛋白3AB能够直接结合到聚合酶前体蛋白3CD上，从而激发3CD蛋白的蛋白酶活性，因此3AB蛋白可能在RNA复制复合物中作为3D聚合酶的锚定［19］。体外表达的3AB蛋白能够刺激PV 3D聚合酶发挥活性。此外，已经证明在VPg尿苷酰化过程中3AB蛋白作为3D聚合酶的底物而发挥作用。3AB蛋白可以掺入复制复合体使VPg尿苷酰化。PV 3AB蛋白具有其他功能，如双螺旋去稳定作用。这表明3AB蛋白在使RNA二级结构松散时具有核苷酸分子伴侣活性［20］。

肠病毒及HRV的3B（VPg）蛋白是一个小的多肽，含有21－23个氨基酸。小RNA病毒基因组的5′端通过存在于VPg上的保守酪氨酸中5′酪氨酰胆碱键能够与VPg共价结合。研究证实VPg与PV 3D聚合酶有相互作用关系，3D聚合酶可以将UMP混合进VPg蛋白生成 VPg－pU和VPg－pU－pU。这些产物在PV感染的细胞中及病毒复制复合体的粗提物中都能够观察到［21］。此时的VPg被用来作为合成正链和负链RNA的引物。

2.3 3CD蛋白和3D蛋白 3CD蛋白是成熟的3C蛋白酶和3D聚合酶的前体，具有蛋白酶活性却没有聚合酶活性［22］。3CD蛋白还参与PV P1前体蛋白的加工处理。PV 3CD蛋白在病毒RNA复制过程中发挥环化病毒基因组的作用，这一作用通过3CD蛋白与病毒RNA的5′端和3′端相互作用来完成［23］。参与病毒IRES启动的蛋白翻译的PCBPs蛋白（poly（rC）binding proteins，PCBPs）和3CD蛋白是核糖核蛋白复合物中的重要组成成员，该复合物与PV基因组的5′端结合并形成茎环结构I（stem－loop I）。在哺乳动物细胞中，PCBPs具有四种亚型（PCBP 1－4），但仅发现PCBP 1和PCBP 2参与肠病毒的复制［24］。PCBP 1和PCBP 2是KH结构域RNA结合蛋白，该类RNA结合蛋白在正常细胞中参与细胞mRNA的代谢。PCBP2可同时结合到PV的IRES和stem－loop I，然而PCBP1只能与stem－loop I结合。另外一个细胞蛋白——异质细胞核核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K）可以与EV71 5′－UTR的stem－loop I－II、stem－loop IV 相互作用。在感染EV71的细胞中，hnRNP K富集在病毒复制的场所——细胞质中，与之相应的是在未感染病毒的细胞中hnRNP K仅存在于细胞核。在hnRNP K表达量下调（siRNA抑制hnRNP K蛋白表达）的细胞中，病毒的产量显著下降并且病毒RNA的合成也迟缓［25］。此外，3CD蛋白被证实也与hnRNP C蛋白相互作用［26］。在正常细胞中hnRNP C参与mRNA前体的加工处理。缺失蛋白与蛋白相互作用活性的hnRNP C突变体表现为抑制病毒正链RNA的合成，这一结果提示我们hnRNP C蛋白参与RNA的复制。3CD蛋白与PCBP，hnRNP C这些细胞蛋白以及病毒蛋白3AB相互作用并结合在PV RNA的stem－loop I结构上形成一个病毒RNA复制复合物。已有报道证明其他数个细胞蛋白也与3CD蛋白相互作用。真核细胞的延伸因子EF－1α可与PV 3CD－stem－loop I复合物相互作用。转录因子OCT－1和核仁分子伴侣B23在HRV16感染时与3CD蛋白一同定位在细胞核。另外，成熟的重组3C蛋白可在体外降解OTC－1。从3CD前体蛋白中解离的成熟3C蛋白起到在细胞核中关闭宿主细胞转录活性的重要作用。

病毒RNA依赖的RNA聚合酶3D蛋白是病毒RNA复制复合物的主要成分之一，从该复合物中纯化的3D聚合酶具有RNA链延伸活性。3D聚合酶可使VPg尿苷化，并以VPg－pUpU为引物起始病毒RNA的复制［27］。PV聚合酶之间的相互作用已经在生化研究和晶体结构研究中被证实。聚合酶的寡聚化被认为与模板的高效利用有关。利用酵母双杂交系统成功鉴定了宿主蛋白Sam68与PV 3D蛋白之间存在相互作用，该相互作用也在PV感染的细胞中观察到。Sam68是一种RNA结合蛋白，它在细胞中介导着可变剪接作为对胞外信号的反应，但是Sam68在病毒RNA复制中的详细功能仍需继续研究。

3 结 语

小RNA病毒利用多种蛋白与基因组RNA相互作用来调节自身生存与繁殖。近年来，宿主细胞因子参与病毒生命活动的相关探索成为了研究热点，阐明病毒和宿主间的相互作用对于理解病毒的复制、毒力和致病性至关重要。然而，不同组织细胞对病毒的敏感性不同，其中的感染机制仍需要深入研究。另外，细胞内存在的众多microRNAs是否具有降解小RNA病毒的能力仍需进一步的验证。理解宿主细胞蛋白是如何与病毒蛋白、RNA相互作用，将为基于它们相互作用设计抗病毒新药提供理论基础。

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