抗红花花粉蛋白单克隆抗体的研制Δ

张庆生，李 波，张凤兰，裴新荣，陈志蓉，王钢力，达 晶，王春香，林瑞超(.中国食品药品检定研究院，北京 00050;.北京康为世纪生物科技有限公司，北京 006))

红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，具有活血通经、散瘀止痛的作用，是一种应用非常广泛的传统中药材［1］。随着科技进步和制药业的发展，红花注射液被广泛应用于闭塞性脑血管病、冠心病、脉管炎等疾病的治疗，并取得了一定的疗效，但中药注射剂的安全问题逐渐浮出水面，主要表现在因中药注射剂引起的各种过敏反应，轻者引起皮疹、呼吸苦难，重者可导致过敏性休克［2-4］。这既威胁患者的身体健康，也对我国中药制药业的发展造成了严重的伤害。因此，构建一个监测中药制剂、尤其是中药注射剂的过敏性反应监控、评价平台，对筛查中药制剂过敏原残留、优化制剂工艺、预防过敏反应的发生具有重要意义。食物、植物、药物、制药杂质残留等都可能诱导过敏反应，而花粉是自然界最常见的过敏原之一［5-6］。本实验应用红花花粉蛋白免疫小鼠，通过筛选针对花粉蛋白的特异性单克隆抗体，尝试构建针对红花注射液的过敏原筛查平台，为优化红花制剂生产工艺、加强质量控制及预防临床过敏反应提供新的思路和方法。

1 材料

1.1 仪器

酶标仪(BIO-RAD 680)，DEM-3型自动洗板机(北京拓普分析仪器有限责任公司生产)，二氧化碳培养箱SANYO，HD-4层析工作站(上海沪西仪器厂生产)，层析柱(Phamacia)，蛋白电泳装置(BioRadⅡ)，蛋白定量检测仪(Amersham Biosciences)

1.2 药品与试剂

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT(次黄嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶脱氧核苷T)培养基、100×HT(次黄嘌呤H、胸腺嘧啶脱氧核苷 T)培养基(、聚乙二醇(PEG)4000、RPMI 1640培养基、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP、Sp2/0细胞株(由北京康为世纪生物科技有限公司提供)。抗体亚型检测试剂盒(SBA Clonotyping System/HRP)(购自 SouthernBiotech公司)，透析袋(购自 BLUEBIRD公司)，超滤管(购自Millipore公司)，Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Bradford Protein Assay Kit)(购自Pierce公司)。红花花粉由山西太原华卫药业有限公司提供。

1.3 动物

BABL/c小鼠购自扬州大学，清洁级，合格证号:SCXK苏2012-0004。

2 方法

2.1 实验药品的制备

称取红花花粉50 g，加入250 ml水，煮2 h，过滤后取滤液80 ml，加入预冷的无水乙醇120 ml(60%)，放置4℃过夜(17 h)，5000 rpm/min离心20 min，弃上清液，沉淀即为红花花粉总蛋白，应用Bradford方法检测蛋白含量。将红花花粉总蛋白作为免疫原。

2.2 免疫方案

选取5只雌性BLAB/c小鼠进行免疫，具体免疫流程如下:第 1 次免疫，按蛋白量 80 μg/只，250 μl/只，配合应用完全弗氏佐剂，背部皮下多点免疫;第2次加强免疫，按蛋白量40 μg/只，250 μl/只，配合应用不完全弗氏佐剂在初次免疫后一周加强免疫;第3、4次加强免疫方案与第1次加强免疫相同;第 5 次加强免疫按蛋白量 80 μg/ml，100 μl/只，采用脾内加强免疫方式进行。

2.3 细胞融合和克隆

第5次加强免疫后3 d，取小鼠脾细胞，采用PEG常规融合方法，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0细胞株进行融合。采用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方法对融合细胞上清进行筛选，经过2次筛选确认阳性细胞孔后，采用有限稀释法对阳性细胞株进行克隆。

2.4 抗体亚型检测

SBA Clonotyping System/HRP购自Southern Biotech公司，按试剂盒操作说明进行检测。

2.5 腹水制备

取BALB/c小鼠，每只注射0.5 ml石蜡油，7 d后将杂交瘤细胞按1×106个细胞/0.5 ml/只给小鼠接种，接种细胞约7～14 d后收集腹水备用。

2.6 抗体纯化

采用结合缓冲液(Binding Buffer)平衡Protein G亲和柱至基线平稳;将腹水样品上柱，收集流穿液;将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳;加入洗脱缓冲液(Eluting Buffer)洗脱，收集洗脱峰，检测纯度;用0.01 M，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在0.01 M，pH值为7.2的PBS中;用蛋白定量检测仪测定纯化后单抗的浓度;对纯化后的抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，上样量 8 μg/抗体。

2.7 抗体特异性鉴定

将红花蛋白按 10 μg/ml，100 μl/孔，4 ℃ 包被过夜。洗涤3次后，加入150 μl/孔3% 牛血清白蛋白(BSA)，37℃封闭2 h;洗涤3次后，将单克隆抗体按 1:3000稀释，100 μl/孔37℃孵育2 h;洗涤3次后，将辣根酶标记的羊抗鼠IgG按1∶5000 稀释后，100 μl/孔，37 ℃ 孵育 1 h;加入 1 × TMB，37℃显色15～30 min，加入50 μl/孔 2 M 硫酸(H2SO4)终止反应。以450 nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)＞2.1为限，作为判断抗体阳性、效价或特异性的临界点。

3 结果

3.1 免疫后血清效价检测结果

经过4次免疫后，5只小鼠血清效价的检测结果见表1(应用硫酸盐缓冲液作为空白对照)。结果显示，5只小鼠均已达到融合标准，其中3号小鼠的效价最高。

表1 红花花粉蛋白免疫血清效价检测结果(OD450 nm)Tab 1 Determination results on antisera titration of safflower pollen protein(OD450 nm)

3.2 单克隆细胞株的筛选

细胞融合后第3、6 d对融和板进行换液，于第7 d对融合细胞进行筛选。共有3个阳性细胞孔，为保证阳性率的稳定，再扩至24孔以再次检测确定。检测结果表明3株均为阳性。应用有限稀释法进行亚克隆，经过3次亚克隆后阳性率达100%，得到1B6，2A11，6H11共3个单克隆细胞株。

3.3 抗体亚型的鉴定

按试剂盒提供方法对所获得的3个单克隆抗体进行亚型鉴定，鉴定结果见表2。1B6、2A11、6H11表示3株细胞克隆的编号，产生的单克隆抗体应用相同编号。检测结果表明所获3株细胞产生的抗体亚型均为IgG1型。

表2 单克隆抗体亚型鉴定(OD450 nm)Tab 2 Subtype identification of monoclonal antibodies(OD450nm)

3.4 抗体特异性鉴定

应用间接ELISA方法，进一步检测各单克隆抗体对红花蛋白抗原识别的特异性，检测结果见表3。单克隆抗体1B6、2A11、6H11较相应空白对照组(应用硫酸盐缓冲液作为空白对照)分别增加了9.63、9.59和6.61倍，结果见图1。结果显示，各单克隆抗体均能特异性识别红花蛋白抗原，均具有较强的特异性。

表3 单克隆抗体对红花花粉蛋白的特异性识别(OD450 nm)Tab 3 Specificity recognition of monoclonal antibodies on safflower pollen protein(OD450nm)

图1 单克隆抗体对红花花粉蛋白的特异性识别Fig 1 Specificity recognition of monoclonal antibodies on safflower pollen protein

4 讨论

4.1 中药注射剂引起的过敏问题

传统中药主要通过口服、外敷等方式应用，再则中药强调辨证论治、君臣佐使，单种药物成分浓度相对较低，因此，历来认为中药毒副作用较小，比较安全。随着科技进步和制药业的发展，中药注射剂、滴丸、喷雾剂等多种剂型在临床应用越来越广泛。但传统中药应用过程中较少出现的毒副作用，如中药注射剂引起的过敏性休克时常发生，并逐渐成为阻碍中药应用、制约企业发展的关键因素。因此，探索中药注射剂致敏的主要原因和发生机制，以改善制药工艺，消除过敏反应的发生成为当前亟待解决的关键问题。

4.2 中药注射剂诱导过敏的机制

与西药注射剂相比，中药注射剂常常成分复杂，诱导过敏反应发生的原因也更为复杂。有研究认为［7］，中药过敏发生的原因与年龄、性别无关，主要与给药途径有关，尤其是注射用药最易诱发过敏反应。于风平等［8］用间接ELISA的方法筛查刺五加注射液中的过敏性杂质成分，并建议应用超滤技术去除过敏性杂质。红花、清开灵、双黄连注射剂等［4，9］均有诱发过敏反应的报道，另外制药中使用的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)等还可诱导类过敏反应的发生［10］。中药药物成分、制药杂质和给药途径都是引起过敏或类过敏现象发生的重要原因。

4.3 构建过敏反应评价平台的目的和意义

由于缺乏适宜的中药注射剂过敏和类过敏反应评价模型，这成为制约中药注射剂发展的重要瓶颈。植物花粉是最为常见的致敏原之一，本研究以红花花粉蛋白作为研究的突破口，希望通过构建针对红花花粉蛋白的特异性细胞克隆、制备特异性单克隆抗体，作为研究红花注射剂过敏原鉴定、筛选的重要工具，也为改良红花注射剂制药工艺、降低过敏反应的发生提供技术支撑。目前，我们已经构建了3株针对红花花粉蛋白的细胞克隆，经鉴定均产生IgG1型抗体，效价较高。应用ELISA的方法，进一步证明这3个单克隆抗体均能识别红花花粉蛋白，并且具有较好特异性。今后，我们将以3个单克隆抗体作为研究工具，首先鉴定单克隆抗体识别红花花粉蛋白的免疫原结构，再探索红花花粉蛋白与红花注射剂诱导过敏反应发生之间的关系，研究红花注射剂关键的致敏原因，并希望研发出能够快速筛查红花注射剂过敏原残留的试剂盒，用于改善红花制剂工艺、降低过敏反应发生风险。期望以此作为工作基础，研究开发出针对多种中药成分的单克隆抗体，将我们的过敏反应评价体系，逐步拓展成为研究和评价各类中药注射剂过敏反应的通用平台，这将对我国中药制药的发展产生积极的推动作用，具有非常重要的意义。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:141-142.

［2］马飞，王丽莉，丁莉莉.红花注射液致过敏性皮疹1例［J］.中国药物滥用防治杂志，2005，11(2):92.

［3］胡斌，谭志萍，王卉川.红花注射液致过敏性呼吸困难1 例［J］.药物流行病学杂志，2006，15(5):309-310.

［4］葛红星，刘艳红，雷招宝.红花注射液致过敏性休克16例文献分析［J］.中成药，2012，34(9):1836-1838.

［5］宋绍雄，高祥文，夏波.200例儿童食物过敏的原因分析［J］.求医问药:学术版，2013，11(1):71-72.

［6］刘志华.花粉过敏的原因、预防和治疗［J］.生物学教学，2013，38(1):52-53.

［7］冯艳霜.187例中药致过敏反应文献分析［J］.药物不良反应杂志，2002，4(2):81-83.

［8］于风平，胡昌勤，崔生辉，等.刺五加注射液中过敏性杂质的分析［J］.中国药学杂志，2008，43(5):384-387.

［9］翁维良，林洪生，高蕊，等.4种中药注射剂皮肤过敏试验方法与意义的探讨［J］.中国中药杂志，2007，32(24):2649-2652.

［10］李黎明，金若敏，李小月.中药注射剂类过敏反应实验研究进展［J］.中药药理与临床，2012，28(1):187-190.