利用温度调节实现新型重组菌高效转化甘油为D-乳酸

田康明，周丽，陈献忠，沈微，石贵阳，Suren Singh，路福平，王正祥

1 江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122

2 发酵粮食国家工程实验室，江南大学，江苏 无锡 214122

3 德班理工大学 生物工程与食品技术学院应用科学系，南非 德班 4001

4 天津科技大学生物工程学院，天津 300457

油脂水解工业中的主要副产物甘油正成为发酵工业中重要的碳源之一[1]。生物柴油工业的健康发展从某种意义上讲，决定于副产物甘油的就地快捷转化工业的成功实施[2]。由于甘油分子较葡萄糖具有更高的还原力，因此，以甘油为碳源的生物转化过程一定有其特点[3-9]。作者所在的课题组，前期建立了好氧菌体生长和微好氧发酵产酸两阶段甘油发酵产D-乳酸的工艺，并通过构建同型乳酸发酵的重组大肠杆菌显著地提高了 D-乳酸的合成速率[10]。不足的是，氧气的存在使得甘油较多地流向了细胞合成，因此，尽管通过增加乳酸脱氢酶的基因拷贝数增强了乳酸的合成效率，最优发酵条件下的乳酸得率达到了78%，但提升的空间仍然巨大[10]。

为进一步提高甘油到D-乳酸的转化率，本研究首先探索不同培养温度下重组菌好氧与厌氧代谢甘油的特征，在此基础上建立并优化了一种新型D-乳酸变温发酵工艺，并进一步引入了温度诱导型D-乳酸脱氢酶的转录系统，甘油到乳酸的得率得到显著提高。

1 材料与方法

1.1 菌株

重组菌 Escherichia coli CICIM B0013-070(B0013, Dack-pta Dpps DpflB Ddld DpoxB DadhEDfrdA)和 E. coli CICIM B0013–070B (B0013-070,ldhAp::kan-cIts857-pR–pL)，由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心 (CICIM-CU，http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供。

1.2 培养基

LB培养基[10]，添加琼脂2%即为固体培养基。发酵培养基[10]：M9培养基添加0.1%的MgSO4母液 (1 mol/L)和 0.1%的微量元素母液。甘油添加量根据不同发酵方式进行确定。

1.3 试验设计方案

1.3.1 最适生长温度和最适产酸温度的确定

在30 ～45 ℃℃条件下确认最适的菌体生长温度；在37 ～50 ℃℃和150 r/min条件下，摇床培养，确认最适的发酵产酸温度。

1.3.2 温度诱导型D-乳酸脱氢酶表达系统的引入

按照文献[11]进行。

2 结果与分析

2.1 适宜的菌体生长温度有助于获得高活性的细胞

发酵工业体系中最高生物量以及最高细胞代谢活力与产物形成最大化之间，往往不能统一，有时甚至互为矛盾。在有机酸发酵过程中，这一矛盾尤为显著[12]。为此，首先探讨了培养温度对细胞生长和产物积累间影响特征，结果如图 1A所示。在34 ～37 ℃℃下表现出最优的生长性能。进一步分析发现，在34 ℃下，好氧菌体生长阶段后期乳酸的积累量明显低于37 ℃ (图1B)。因此，选择34 ℃培养温度为菌体生长的最适温度。

2.2 发酵阶段适度提升发酵温度更有利于D-乳酸合成

在获得了较高活性的菌体后，发酵温度达到42 ℃时，菌体总量较发酵初始时没有明显增加，乳酸积累量则达到最大值。在此温度下，甘油到乳酸的得率最高 (图2)。

2.3 变温工艺下重组菌合成 D-乳酸的效率得到显著提升

在7 L发酵罐中，细胞生长阶段使用34 ℃培养，发酵产物形成阶段使用42 ℃培养。好氧阶段由原来的9.7 h缩短为9.4 h。产物形成阶段，升高的培养温度，提高了乳酸脱氢酶的催化活性并限制了菌体的生长，甘油到乳酸的得率提高到 82.6%(图 3A)。

2.4 温度诱导 D-乳酸脱氢酶表达提高了甘油到D-乳酸的转化效率

将ldhA的启动子替换为温度诱导型l噬菌体的pR-pL串联启动子，获得了重组菌070B[11]。在7 L发酵罐中，好氧阶段的生长周期进一步缩短为8.7 h。变温发酵工艺下，经过30 h的好氧菌体生长和微好氧发酵产酸过程，发酵液中的乳酸终浓度达到127.0 g/L，产酸速率也由3.66 g/(L·h)提高到 4.23 g/(L·h)。甘油到乳酸的得率进一步提高到88.9% (图 3)。

大肠杆菌利用甘油合成乳酸的研究，始于2009年清华大学首次报道的一株野生大肠杆菌代谢甘油合成乳酸的研究[13]，尽管野生菌株合成乳酸过程中伴生了乙酸、琥珀酸、甲酸和酒精等副产物[10,13-14]。随后的研究中，通过代谢途径修饰实现了甘油到乳酸的同型发酵生产[2,10]，但全程限氧发酵工艺中，甘油到乳酸的转化速率不高[2,13]。因此，作者所在的课题组提出了充分好氧获得足够的菌体活性，然后在转入微好氧发酵产酸的发酵方式[10]。

图1 不同温度下E. coli CICIM B0013-070的生长特征和D-乳酸合成Fig. 1 Growth and D-lactate yield of CICIM B0013-070 at different temperatures. (A)Cell growth. (B)D-lactate yield.

图2 发酵产酸阶段不同发酵温度下E. coli CICIM B0013-070菌体量的积累和乳酸生成Fig. 2 Biomass accumulation and D-lactate production of E. coli CICIM B0013-070 during the fermentation phase under different temperature. (A)Cell growth. (B)D-Lactate accumulation.

图3 变温工艺下重组菌在7 L发酵罐中的生长和产酸情况Fig. 3 Cell growth and D-lactate production using temperature-switched fermentation process. The arrow indicates the time when the culture was switched from the aerobic cultivation at 34 °C to the microaerobic production phase at 42 °C. (A)E. coli CICIM B0013-070. (B)E. coli CICIM B0013-070B; ■: D-lactate; ●: acetate; ▲: succinate; □: pyruvate; △: cell mass.

温度提高对菌体生长的限制存在多种解释。目前被认可的一种解释是，温度提高后，用于赖氨酸合成的关键酶的活性降低，导致甲硫氨酸合成受阻，最终导致菌体生长受到限制[15]。可以确认的是，发酵温度升高到42 ℃后，菌体的生长受到了一定的限制，而乳酸的合成过程在发酵阶段前期有所增强，因此最终提高了甘油到乳酸的转化效率。引入D-乳酸脱氢酶温度诱导表达后，使得在整个发酵产酸过程中D-乳酸脱氢酶的酶活水平持续维持在较高的水平，从而实现了甘油到乳酸的高效合成。可以看出，变温发酵工艺的建立和温度诱导型乳酸脱氢酶转录系统的引入有效地提高了甘油到乳酸的合成速率和得率。这一过程的实现对于解决其他重大发酵产物合成过程与菌体生长之间的矛盾关系同样有借鉴意义。

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