绵羊角蛋白中间丝基因KIF1.2的克隆及序列分析

刘 鑫 姜仁军 王 成 李树伟，*

(1 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)(2 塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔843300)

羊毛是羊皮肤的衍生物，羊毛的品质主要决定于羊毛皮质内的毛纤维。羊毛纤维具有高度的组织结构，角蛋白及其关联蛋白是其构成的主要组成成分。角蛋白相关蛋白基因(keratin associated proteins，KAP)是编码毛发纤维组成蛋白的一种结构基因，由多基因家族编码［1］。它与羊毛纤维的品质密切相关。同时也与遗传，营养、生理及环境等因素有关。不同地区、不同品种绒山羊所产生的羊绒有明显的品质差异［2］。羊毛纤维的90%是由角蛋白中间丝(Keratin intermediate filament，KRT－IF)和角蛋白关联蛋白(Keratin associated proteins，KAPs)所构成。要提高羊毛品质的关键问题是要调控决定羊毛品质的基因，特别是毛囊角蛋白基因是如何发生基因表达来参与羊毛性状的调控等这些复杂因素和相关基因位点及相互之间的关系还不很清楚。当前，科学家们的研究热点主要是针对构成羊毛纤维的角蛋白中间丝(Keratin intermediate filament，KRT－IF)和角蛋白关联蛋白(Keratin associated proteins，KAPs)的相关基因的研究上［3］。

目前，大部分研究都集中在对毛囊KAPs 基因家族多态性的课题研究上，对一个品种的单个基因的深入研究并不多。因此，本研究以南疆地方品种羊和田羊为试验动物，以KIF1.2 角蛋白中间丝基因为研究对象，成功克隆KIF1.2 基因，并进行生物信息学分析，旨在为深入探讨绵羊毛囊KIF1.2 基因的表达对绵羊性状的影响提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验样本

本课题组在动物试验站饲养的和田羊平原型和山区型，样品的总RNA的由本课题组提供，储存于－80℃冰箱中备用。

1.2 实验仪器

智能型热循环仪PCR 仪(IcyclerTM Thermal Cycler)、移液器(Eppendorf)等。台式小型高速离心机(MIKR0120)，电泳仪(Bio－ RAD)，凝胶分析系统(GELDOC2000)，低温高速冷冻离心机(德国SIGMA)，蛋白电泳仪(北京六一仪器厂)，高压灭菌锅(HVE50)。

1.3 实验药品与试剂

ExTaq 酶、限制性内切酶EcoR I、Nde I、RNase Inhibitor、dNTP、DNA Maker(DL2000 和DL15000)均购自TaKaRa 宝生物工程(大连)有限公司。UNIQ－10 柱式DNA 胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京天根生物有限公司。氯仿、TEMED、异戊醇、异丙醇、MgCl2、NaCl、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为国产分析纯试剂。

1.4 菌株与质粒

大肠杆菌DH5α 感受态细胞、克隆载体pMD18－T 为本实验室保存。

1.5 角蛋白中间丝基因KIF1.2的PCR 扩增

1.5.1 引物的设计与合成

和田羊毛囊角蛋白中间丝KIF1.2 基因PCR 引物的设计与合成参照GenBank 中公布的普通绵羊基因序列KIF1.2(M23912.1)设计一对引物，上游引物(P1):5’－CATATGTCTTTCAACTTCTGCC－3’，下游引物(P2):5’－GAATTCCTGGTGCACAAAGGTGTTGC－3’。预期扩增的片段大小为1215 bp。引物由生工生物工程(上海)技术服务有限公司合成。

1.5.2 KIF1.2 基因的PCR 扩增

以反转录合成的cDNA 第一链为模板，PCR 扩增KIF1.2 基因。反应体系25 μl，其中，模板DNA 1 μl，上下游引物各为0.5 μl(10 μΜ)，Ex Taq 酶0.2 μl(5 U/μl)，dNTP 0.5 μl，10 × TaqBuffer 2.5 μl，ddH2O 18.9 μl。反应条件为94℃10 min;94℃45 s，退火温度45 s，72℃1 min，35 个循环;72℃延伸10 min 。扩增片段大小为1215 bp。目的基因的回收、连接、转化、鉴定均按常规方法操作［4］。取5 μl的PCR 扩增产物进行电泳检测，将扩增的单一目的条带进行回收。所有PCR 纯化回收后的产物于－20℃冰箱保存备用。

表1 KIF1.2 基因PCR 扩增体系

1.5.3 PCR 产物和载体的连接与鉴定

将回收的角蛋白中间丝KIF1.2 目的基因PCR产物定向连接到pMD18－T 载体上，热激法转化大肠杆菌DH5α 并进行蓝白斑筛选，将经过PCR 鉴定的阳性质粒DNA 用Nde I 和EcoR I 双酶切鉴定，将上述鉴定所得到的阳性重组子送至生工生物工程(上海)有限公司测定序列。

1.5.4 序列分析

序列同源性分析采用DNAMAN 软件完成。

2 结果

2.1 目的片段的扩增结果分析

对提取的和田羊山区型和平原型皮肤毛囊总RNA 进行反转录获得cDNA，通过PCR 扩增，进行1%琼脂糖凝胶电泳。(图1)可见在1215 bp 处有明亮的特异性条带，阴性对照无条带，结果显示片段的大小和预期的结果一致，初步表明正确的扩增基因的目的片段。

图1 KIF1.2 基因目的片段PCR 扩增

2.2 重组质粒的PCR 检测及酶切鉴定

将初步鉴定出来的质粒DNA 为模板进行PCR扩增并用NdeI 和EcoR I 双酶切检测(山区型)，均获得了大小为1215 bp的单一明亮条带(图2，图3)

2.3 测序结果

图2 KIF1.2 基因重组质粒PCR 电泳

通过DNAMAN 软件将质粒测序的结果与Gen-Bank KIF1.2(M23912.1)进行对比分析表明，该序列全长1215 bp 大小，其中共有三处碱基突变，分别是915 bp 处T 突变为C，1136 bp 处G 突变为A，1139 bp 处A 突变为G，同源性为99%，说明该序列呈现高度的保守性，KIF1.2 基因克隆成功。

图3 KIF1.2 基因重组质粒酶切鉴定(山区型)

图4 KIF1.2 基因序列比对图

3 讨论

绵羊羊毛是畜牧业经济的主要支柱，新疆作为我国重要的绵羊生产基地之一，细羊毛产业在国内处于领先地位，南疆地方品种羊和田羊其毛被两型毛多，长而均匀，毛的弹性、光泽和洁白度较好，是纺织工业的优质原料。但和田羊也存在体格较小，产毛量、产肉率和繁殖率不高等缺点。近些年来，随着分子生物学技术的进步，绵羊羊毛的性状研究已经进入了分子遗传水平阶段，也一直是国内外很多专家学者研究的热点。

对于角蛋白及其关联蛋白的研究，科学家们对人，小鼠，绵羊的毛囊角蛋白及其关联蛋白研究得比较多，山羊的毛发角蛋白及其关联蛋白基因也有相关的报道［5，6］。到目前为止，科学家们估计角蛋白的数量大约在100 个，因为角蛋白及其家族成员的大小和电荷都很相似，目前单一的电泳技术很难将所有的蛋白都分离出来。角蛋白中间丝蛋白KIF 包括两个家族，即酸性(I 型)和碱性(Ⅱ型)角蛋白，脊椎动物的KIF 由50 多个基因编码，在毛囊发育过程中，I 型和Ⅱ型共聚构成约10 nm的微丝纤维，充满基质角蛋白形成微丝束［7］。据报道，角蛋白中间丝I 型Ⅱ型基因家族在基因组中并不是紧密连锁，I 型Ⅱ型基因是成簇分布的，并且角蛋白Ⅱ型可能含有保守的不同于上皮细胞的C 端结构域［8］。

利用绵羊毛囊毛角蛋白和角蛋白关联蛋白基因，通过基因技术改变羊毛纤维的蛋白组成，可以产生更加优良的纤维类型。编码羊毛I 型中间丝角蛋白KIF1.2 基因包括两端500 bp的DNA 侧翼，测序表明其原始转录本长度为5180 bp，具有7 个外显子［9］。高水平皮质特异性表达羊毛II 型角蛋白中间丝基因KIF，能够显著改善羊毛纤维的微观结构，转基因羊毛纤维表现色泽亮而且弯曲度降低。同时，过度表达K2.10的转基因产物构成大多数的II型中间丝蛋白不能和许很多表达的内源性角蛋白I型中间丝构成异二聚体［10］。与非转基因的羊毛纤维相比较，转基因羊的纤维皮层细胞中很难找到中间丝微纤维。最终对纤维结构的影响效果是，扰乱了纤维皮质中正皮质与副皮质细胞的组成，能造成纤维弯曲度降低的因素之一。

本实验根据参照GenBank 中公布的普通绵羊基因序列设计合成了和田羊毛囊中间丝角蛋白KIF1.2 基因引物，以南疆地方品种和田羊毛为实验材料，应用PCR 法成功获得了中间丝角蛋白KIF1.2基因的成熟编码序列。经生物信息学分析，序列全长大小为1215 bp，有三处碱基发生突变，分别是915 bp 处T 突变为C，1136 bp 处G 突变为A，1139 bp 处A 突变为G，同源性为99%。表明该序列呈现高度的保守性。中间丝角蛋白KIF1.2 基因的克隆为进一步构建表达载体以及制备其多克隆抗体提供了基础依据，从而为深入研究南疆地方品种绵羊角蛋白家族基因的定位，以及对羊毛性状的调控机制等方面提供理论指导。

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