药物肝损伤的潜在生物标志物循环miR－122的研究进展

王 雁，汤纳平，马 璟

(中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203)

据报道，肝毒性成为上市药物被召回的主要原因[1]，在FDA批准上市的药物中，80%以上的黑框警告药物属于严重肝损伤药物[2]。目前国际上认可的临床前安全性评价技术指导原则中，有关肝毒性的评价主要从临床生化指标如血清转氨酶和总胆汁酸等、组织病理学和超微病理学、活性代谢产物及免疫相关指标4个方面进行评价[3]。然而这些常规的毒理学研究终点均因灵敏性、稳定性和特异性较差而不能为肝毒性评价提供早期准确的信息。例如，目前肝损伤评价的“金标准”丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransaminase，AST)，在检测肝损伤过程中有很多局限:①在肾损伤和骨骼肌损伤时也可检测到血清ALT升高[4－6];② 血清ALT水平要达到对照组的2～4倍才能被认为是肝损伤，临床上很容易错过肝损伤最佳治疗时期[3，7];③ 出现假阳性或假阴性，如非诺贝特可以诱导血清转氨酶升高但却无明显的肝损伤。近几年来，随着分子生物学技术的发展，使大规模筛选灵敏可靠的肝毒性生物标志物成为可能[8－11]。然而，迄今为止仍未发现比ALT和AST更具有优越性的生物标志物。目前，大量的验证性研究正在进行中。

微RNA(microRNA，miRNA)是一类全长为19～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，由茎环状结构的转录前体加工而成。在进化上高度保守[12]，通过与靶mRNA 3'端部分或完全互补，可以抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA从而调控靶基因的表达。因此在机体生理和病理过程中起着很重要的作用。随着miRNA鉴定方法的改进，越来越多的miRNA被克隆，并根据克隆的先后顺序在miR后加上阿拉伯数字来命名，如 miR－1。研究表明，肝特异性表达的miR－122参与肝细胞发育、表型、分化代谢和应激应答等过程[13－16]。与传统的肝毒性评价指标相比，循环 miR－122可以有效地区分肝损伤和肝外损伤[17－18]，且比传统的蛋白指标反应灵敏[13，19]，预测性较好[17]，与组织病理学结果具有很高的相关性，在个体之间的反应较一致[19－20]。因此，与成分比较复杂、易变性、易降解的蛋白质相比[21－22]，丰富而稳定的短链循环miR－122有望成为药物肝毒性临床前安全性评价的生物标志物[23－24]。

理想的生物标志物需具备高特异性、灵敏性和非侵袭性等特征(表1)[25]，因此，本综述将从稳定性、特异性和灵敏性3个方面阐述循环miR－122作为药物肝毒性安全评价指标的潜在优势。

表1 理想生物标志物的特征

1 循环miR－122的来源及稳定性

2008年，Lawrie等[26]首先发现了循环血液中 miRNA的存在，这一重大发现为miRNA作为非侵袭性标志物以及应用在癌症疾病的预防和诊断方面奠定了基础。随后，Mitchell等[27]和 Chen 等[24]报道血浆或血清中存在稳定的miRNA。

1.1 循环miR－122的来源

外周血miR－122在病理状态下表达水平明显升高，显示其作为肝损伤特异性生物标志物的潜能。但循环miR－122的来源及与肝组织细胞中miR－122的关系尚不清楚。Wang等[13]在小鼠暴露对乙酰氨基酚24 h后，分别检测小鼠肝和血清中 miRNA的表达谱发现，与对照组相比，小鼠肝miR－122的表达显著性降低，而血清miR－122的表达升高最明显。并推测，血清中miR－122的升高可能像血清ALT和AST一样是由坏死和受损细胞漏出或分泌所致，但这一推断还需要进一步实验证实。

Chen等[24]发现，机体正常状态下，循环miRNA的表达谱和血细胞miRNA表达谱有较高一致性，而病理状态循环miRNA表达谱和正常机体血细胞miRNA表达谱相关性很低，与损伤机体血细胞miRNA的差异也增大。这说明在正常状态下，血清miRNA主要是由血细胞分泌而来，而在组织病变时，血清 miRNA主要来自受损的组织细胞。关于miRNA如何从组织细胞进入血循环中，主要有2种推测[28－30]:① 被动漏出;② 主动分泌。目前已有一些研究证实了miRNA的主动分泌[31－33]。这些也都为循环 miR－122的来源提供了线索。McDonald等[34]研究发现，在游离血红蛋白浓度达到12.0 g·L－1时，溶血现象对循环 miR－122的表达无任何影响，这与正常状态下血循环中miRNA来源于血细胞有悖。因此，循环miR－122的来源及其与肝组织细胞miR－122的关系仍需要深入研究。

1.2 循环miR－122的稳定性

研究表明，循环miRNA在外周血中可以高度稳定地存在[24，27]。Chen 等[24]通过研究不同条件(高温煮沸、低/高pH、长期储存和反复冻融等)处理后的血浆miRNA表达水平，结果显示，这些处理条件下的miRNA与未处理的血浆中miRNA表达水平并无明显差异。为了证明miRNA可以抵制血浆RNA酶的降解，在消化和未经消化处理的RNA酶A血浆样品中，通过RT－PCR分析表明，RNA酶A对血浆中miRNA并没有产生影响，3 h之内仍保持完整结构。因此，相对于成分比较复杂、易变性和易降解的代谢物，循环miRNA更适宜作为生物标志物。

目前，关于体液miRNA能够稳定存在的原因仍在研究中。研究显示，循环中miRNA被细胞分泌的胞外体或微泡等包裹，并且由它们的膜性结构保护[35－36]。Turchinovich 等[37]在研究胞外miRNA特征时，证明miRNA之所以在细胞外能长期稳定存在，主要是因为形成了一种miRNA/Ago2复合体，而该复合体可以有效地抵抗核酸酶/蛋白酶。关于循环miR－122稳定的确切分子机制仍需要进一步研究。

2 循环miR－122生物标志物的肝特异性

2.1 肝组织的高表达

Lagos－Quintana 等[38]通过克隆成年小鼠特定组织的miRNA以确定miRNA在不同组织分布的实验中证明，miR－122占所有肝克隆的miRNA的72%，并且在其他组织中未检测到miR－122的表达。Chang 等[39]进一步使用 RT－PCR 检测miR－122在成年大鼠的不同组织的表达水平，其中在成年大鼠肝中，每个肝细胞的miR－122的表达水平高达50000拷贝。而在肺、脾、心脏和骨骼肌的表达几乎检测不到。

Baskerville等[40]利用微阵列芯片表达谱技术研究了175种miRNA在人类24个组织器官中的表达，通过对175种miRNA表达谱的层级聚类分析得到各种miRNA在不同组织的表达特异性，其中miR－122在肝中相对表达量为1000，而在其他组织相对表达量均≤10。

Kim等[41]通过挖掘有关研究miRNA表达谱的文献，并对每个相对独立的表达谱进行相关性分析和SOM算法聚类分析，结果表明，miR－122在肝中表达信号最强而在其他组织表达信号很低甚至无信号。

上述关于miRNA的表达分析表明，miR－122在肝中高度表达，在其他组织表达很低甚至检测不到，其表达量占肝中所有miRNA的70% 以上。因此，通过检测外周血中miR－122的变化，就可以预测药物对肝是否有损伤作用，从而也可以预测新药的毒性作用靶点。

2.2 与肝损伤的相关性

Starkey Lewis 等[17]研究了循环 miR－122 与对乙酰氨基酚急性中毒的关系，并进一步检测了外周血中脑组织高度表达的miR－128、肝组织高度表达的miR－129和心脏富集的miR－1的变化。与对照组相比，肝组织高表达的miR－122有显著性升高，血清miR－218无明显改变。通过Pearson相关性分析，对乙酰氨基酚急性中毒组血清miR－122表达水平与血清ALT活性有较好的相关性，血清miR－129和miR－1与血清ALT活性的相关性均很差。同时在慢性肾损伤模型中，外周血miR－122也只有轻微的变化，且血清miR－122在对乙酰氨基酚中毒患者和慢性肾损伤患者外周血中的表达水平有显著性差异。进一步监测肝移植后的对乙酰氨基酚急性中毒患者血清miR－122的表达水平与ALT活性的改变，发现血清miR－122表达早于ALT达到正常的基线水平。

Zhang等[18]通过实时定量PCR技术检测慢性乙肝患者外周血miR－122表达的变化，发现miR－122显著升高，且与肝组织病理学变化程度和血清ALT峰值有很好的相关性。为了进一步证明miR－122作为肝损伤生物标志物的特异性，又比较了健康个体和仅肌肉损伤患者血浆miR－122差异，结果发现，肌肉损伤导致血清ALT活性升高7.8倍，而肌肉损伤患者外周血miR－122较正常组无显著性变化。

由此可知，miR－122的表达水平与肝损伤程度密切相关，在药物诱导的肝损伤模型中，miR－122发生特征性的改变，呈剂量依赖性且较传统的肝损伤标志物血清转氨酶特异性高。

3 循环miR－122生物标志物的灵敏性

目前，虽然尚不清楚miR－122在肝损伤病理过程中如何发挥作用，但动物实验证实，循环miR－122在肝损伤早期就可以检测到有显著性升高，较传统的肝毒性生物标志物灵敏。

Wang等[13]在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤模型中发现，给药后24 h，血浆中有44种miRNA的表达水平是对照组的2倍以上，其中25种显著升高，而miR－122变化最显著。为了检测miR－122的灵敏性，他们在给予对乙酰氨基酚不同剂量后1和3 h检测血浆miR－122和ALT的变化，两者都呈现出剂量和时间依赖性，但对乙酰氨基酚过量暴露引起miR－122的变化更加明显，而且在亚毒性剂量给药后3 h和中毒剂量给药后1 h，就可以检测到血浆中miR－122的升高，血清转氨酶却无明显变化。Laterza等[20]研究了CCl4和CBrCl3诱导的大鼠肝损伤模型中肝特异性miR－122在外周血中的变化。结果显示，在组织病理学观察到明显的肝细胞凋亡和坏死时，与对照组相比，血浆miR－122升高的倍数较ALT升高倍数明显。另外，在分析肝损伤模型组单个动物血浆miR－122和ALT变化与组织病理学结果相关性时，每只动物血浆miR－122的升高与肝细胞凋亡、坏死具有一致性，而血清ALT个体之间变化比较大，有些动物血清ALT只有轻微升高或明显升高，而有些动物甚至检测不到血清ALT的变化。

Yamaura等[19]在研究对乙酰氨基酚诱导SD大鼠肝损伤模型中，同样证实了 miR－122在给药后3 h开始升高，12 h达到峰值，而血清ALT在给药后6 h开始升高，24 h达到峰值。在比较动物个体之间的差异时，miR－122的变异系数为8.21%，ALT的变异系数为 80.7%。因此，循环miR－122在动物个体之间的反应较血清ALT一致。

上述研究成果提示，外周血miR－122作为肝损伤潜在生物标志物较传统的肝损伤评价标准血清转氨酶更加灵敏，而且在动物个体之间的变化比较一致。

4 展望

循环miR－122因其在肝组织表达的特异、稳定和灵敏而有望成为肝毒性新的可靠的生物标志物。比起标准的ALT/AST测试，循环miR－122可以为早期肝损伤提供灵敏和特异性的指标。又因为miR－122在进化上的高度保守且已在临床试验中检测到，因此，其在临床前诊断结果可以为临床试验提供参考，而且循环miR－122生物标志物更易推向临床实践。

根据FDA和ICH分别颁布的关于新的生物标志物认证指导方案[42－43]，一个新的生物标志物的认证需要大量的研究数据支持。循环miR－122是否能够代替传统的肝毒性评价指标或者作为肝毒性评价的补充指标，尚需要更多更深入的研究来证明，比如必须明确循环miR－122表达与特定的药物、具体的肝损伤机制或整体肝损伤的相关性，及其对肝损伤的预测及预后价值。更重要的是，需要阐明肝正常状态下和被损伤时，循环 miR－122的来源和它与肝组织细胞miR－122的关系，从而为循环miR－122作为肝损伤药物安全评价生物标志物提供更充分的证据。另外，血清转氨酶之所以能成为目前肝损伤的标准检测指标，还在于其临床上快速、简便的检测方法。因此，研发循环miR－122更为精确、可行、方便和经济的检测方法显得很有必要。

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