鼠源T细胞受体单克隆抗体对Ⅱ型胶原诱导DBA/1小鼠关节炎的治疗作用

韩春光，黄火高，王 琼，高志清，彭明丽，承京霞，刘永学

(1.军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理学与毒理学研究室，北京 100850;2.中国人民解放军海军总医院干部保健科，北京 100037)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性进行性的自身免疫性疾病，以关节滑膜炎和对称性、破坏性的关节病变为主要特征。近年来，免疫分子在RA发病中的作用越来越受到人们重视。抗原提呈细胞通过T细胞受体(T cell receptors，TCR)与T细胞识别，后者在B7共刺激因子的作用下被活化，活化的T细胞再激活巨噬细胞，由巨噬细胞产生多种炎性细胞因子，这些炎性细胞因子进一步作用于巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞和成骨细胞，通过细胞基质金属蛋白酶和NF-κB受体激活物的配基等导致软骨和骨破坏[1]。由此提示，TCR抗体对RA可能具有一定的治疗作用。本研究制备DBA/1小鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis，CIA)小鼠模型，观察鼠源 TCR(mouse TCR，mTCR)单抗对RA的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和仪器

DBA/1小鼠，体质量20～24 g，18周龄，雄性，购自上海药物研究所，SPF级饲养，动物合格证号:中科动管会第001号。地塞米松磷酸钠注射液，天津金耀氨基酸有限公司;mTCR单抗，美国Gene Tex公司。牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂，美国Chondrex公司。Luminex200型多功能流式液相芯片分析仪，美国Millipore公司。

1.2 动物分组、模型制备和给药

将DBA/1小鼠随机分为正常对照、模型、地塞米松0.5 mg·kg－1和 mTCR 单抗25 mg·kg－1治疗组，每组6只。CIA小鼠模型的制备按照文献[2]进行。除正常对照组外，将牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂充分混合，制成胶原乳剂，含Ⅱ型胶原2 g·L－1，每只小鼠尾根部皮内1次注射100 μl，将注射当日记为第1天，于第21天加强诱导1次。地塞米松治疗组于第29～41天皮下注射地塞米松磷酸钠注射液，隔日一次;mTCR单抗治疗组分别于第0和第21天皮下注射给药1次;正常对照和模型对照组皮下注射等体积生理盐水。

1.3 体质量和足掌厚度测量、关节炎评分及CIA发生率计算

以电子天平动态称量小鼠体质量，每周2次。以游标卡尺测量小鼠足掌厚度。关节炎炎症指数评分标准:0分，关节正常;1分，关节轻微红肿;2分，关节红肿严重，累及整个关节;3分，足爪或关节功能障碍，关节僵硬。每只小鼠的关节炎症的总评分为四肢评分的总和，每只小鼠的最高分值为12分，关节总评分大于1的小鼠为建模成功小鼠[3]。

1.4 踝关节组织病理变化观察

连续观察到给药后第60天实验结束，处死小鼠，取踝关节进行组织切片，HE染色，镜下观察组织病理改变，包括关节组织炎症细胞浸润和骨骼破坏。

1.5 血清细胞因子测定

连续观察到给药后第60天实验结束，取血清，通过Luminex200液晶芯片分析平台，测定小鼠血清 γ 干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素 4(interleukin-4，IL-4)的含量。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 mTCR单抗对CIA模型小鼠体质量和足肿胀度的影响

实验过程中，各组小鼠体质量无明显变化。CIA发生发展过程中，小鼠的受累关节首先表现为肿胀，足掌厚度明显增加(P＜0.01)。与模型组比较，第31～59天，地塞米松和mTCR单抗治疗组足掌厚度明显降低(P＜0.01)(图1)。

Fig.1 Effect of mouse monoclonal antibody of T cell receptors(mTCR mAb)on thickness of foot palm of collagen typeⅡinduced arthritis(CIA)model mice.On the 1st and 22nd day，bovine typeⅡcollagen and complete Freund adjuvant emulsion was injected intradermally in order to prepare the CIA mouse model.From the 29th to 41st day，dexamethasone sodium phosphate injection 0.5 mg·kg －1was sc given to the mice of dexamethasone treatment group every other day.The mice of mTCR mAb group were sc injected mTCR mAb 25 mg·kg －1on the 0(before model preparation)and 21st day，respectively.After administration for 60 d，the thickness of foot palm was mearsured.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.2 mTCR单抗对CIA模型小鼠关节炎指数的影响

如图2所示，自第28天发病开始，CIA模型组小鼠关节炎指数逐渐增加(P＜0.01)。与模型组比较，地塞米松和mTCR单抗治疗组小鼠的炎症指数明显减小(P＜0.05，P＜0.01)。

Fig.2 Effect of mTCR mAb on joint inflammatory index in CIA model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.3 mTCR单抗对CIA模型小鼠CIA发生率的影响

从第29天开始，模型组小鼠逐渐出现关节红肿和关节活动受限等典型的CIA病变。第42天，模型组CIA发生率已达6/6，地塞米松和mTCR单抗治疗组分别为2/6和1/6;第49天，模型组和地塞米松治疗组CIA发生率维持不变，mTCR单抗治疗组升高为5/6(表1)。

Tab.1 Effect of mTCR mAb on incidence of CIA in DBA/1 mice

2.4 mTCR单抗对CIA模型小鼠踝关节组织病理变化的影响

与正常组(图3A)相比，模型组小鼠踝关节表现为大量炎症细胞浸润，骨侵蚀明显(图3B);与模型组比较，地塞米松和mTCR单抗治疗组小鼠仅有少量炎症细胞浸润，而且骨侵蚀不明显(图3C，D)。

Fig.3 Effect of mTCR mAb on pathological changes of ankle joints in CIA model mice(200 ×).See Fig.1 for the mouse treatment.A:normal control;B:model;C:dexamethasone;D:mTCR mAb.⇑:bony erosion;↑:inflammatory cells infiltrate.

2.5 mTCR单抗对 CIA模型小鼠血清 IFN-γ，IL-4和TNF-α含量的影响

表2结果显示，与正常组相比，模型组小鼠血清IL-4含量明显降低(P＜0.05)，TNF-α 含量明显增加(P＜0.01);与模型组相比，地塞米松和mTCR单抗治疗组小鼠IL-4含量显著增加(P＜0.05)，TNF-α明显降低(P＜0.05);各组小鼠血清 IFN-γ含量无明显变化。

Tab.2 Effect of mTCR mAb on serum concentration of interferon-γ(IFN-γ)，interleukin-4(IL-4)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in CIA model mice

3 讨论

RA是一种常见的自身免疫性疾病。T细胞介导的免疫调节紊乱是其发病机制之一。据报道，RA受累关节局部T细胞数量明显增加，而且病变程度与T细胞聚集程度密切相关[4]，提示T细胞及其有关的免疫炎症反应参与了RA的发生发展过程。因此，免疫反应与炎症细胞、炎症介质和细胞因子等各自作用和相互关系已成为目前治疗RA研究的重要内容之一[5]。

RA涉及的细胞免疫反应主要与某些特定的T细胞亚群有关。TCR是成熟T细胞的特征性标志，与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)形成HLA-抗原-TCR复合物，并激活T细胞，是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子，也是TCR单抗有望成为RA防治药物的理论基础[6]。

本研究结果发现，mTCR单抗可以降低CIA的发生率，明显减轻足掌肿胀度，降低关节炎症指数，明显降低炎症细胞浸润和骨破坏。由此提示，mTCR单抗对CIA具有一定的治疗作用，也进一步证实T细胞参与RA的发病过程。但自给药后第45天开始，mTCR单抗治疗组足掌厚度和炎症指数有所升高;第49天以后CIA发生率升高，接近模型组;上述结果提示本研究mTCR单抗的给药方案需进一步改进，如增加给药次数等。

RA发病过程中 T辅助细胞1(T helper 1，Th1)和Th2平衡失调[7]，它们主要通过分泌不同的细胞因子影响RA的发展过程。Th1细胞产生IFN-γ，IL-2和TNF-α等，参与细胞免疫反应;Th2细胞产生IL-4和IL-10等，参与体液免疫反应。本研究结果表明，模型组小鼠血清TNF-α水平显著高于正常对照组，IL-4水平低于正常对照组;与模型组相比，地塞米松和mTCR单抗治疗组血清TNF-α含量明显降低，IL-4含量明显升高，提示CIA模型小鼠Th1/Th2平衡失调，地塞米松和mTCR单抗均可恢复其平衡，mTCR单抗对CIA的治疗作用可能与调节细胞因子水平、恢复Th1/Th2平衡有关。

[1]Xi ZD， Zhang DQ， Zhang YY， Zang JW.Research advances on collagen-induced arthritis in mice[J].Nat Mag(自然杂志)，2003，25(1):46-41.

[2]Cheng JX，Han CG，Wang Q，Xu JP，Liu YX.Characterization of collagen induced arthritis in DBA/1 mice[J].Pharm J Chin PLA(解放军药学学报)，2007，23(2):94-96.

[3]Aerts NE，Dombrecht EJ，Ebo DG，Bridts CH，Stevens WJ，De Clerck LS. Activated T cells complicate the identification of regulatory T cells in rheumatoid arthritis[J].Cell Immunol，2008，251(2):109-115.

[4]Boissier MC，Assier E，Biton J，Denys A，Falgarone G，Bessis N.Regulatory T cells(Treg)in rheumatoid arthritis[J].Joint Bone Spine，2009，76(1):10-14.

[5]Kato I， Endo-Tanaka K， Yokokura T. Suppressive effects of the oral administration of Lactobacillus casei on typeⅡ collagen-induced arthritis in DBA/1 mice[J].Life Sci，1998，63(8):635-644.

[6]Cush JJ， Lipsky PE. Phenotypic analysis of synovial tissue and peripheral blood lymphocytes isolated from patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，1988，31(10):1230-1238.

[7]Raychaudhuri S. Recentadvances in the genetics of rheumatoid arthritis[J].Curr Opin Rheumatol，2010，22(2):109-118.