穿琥宁抗炎作用的血红素加氧酶-1的信号转导机制

张 波，龙 隆，王莉莉，刘克良，宫泽辉

(军事医学科学院毒物药物研究所1.新药评定研究室，2.药物化学研究室，北京 100850)

穿琥宁系穿心莲提取物穿心莲内酯经结构改造后所得化合物，是以穿心莲内酯为母核在其侧链的羟基位点进行了酯化、脱水、成盐而成。穿琥宁具有消炎退肿、解热镇痛、抗菌和抗病毒的作用，在临床上常用于治疗外感高热和急性感染性疾病等[1－2]。以往研究主要集中在探讨原型药物穿心莲内酯的抗炎作用机制，提示其抗炎机制主要与阻断NF－κB寡核苷酸与核酸蛋白的链接，进而降低诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和环氧化酶 2(cyclooxygenase 2，COX－2)表达有关[3]。以往研究认为，穿心莲内酯通过抑制NF－κB活性，降低炎性蛋白iNOS和COX－2的表达及NO和PGE2的产生是穿心莲抗炎机制之一[4]。NF－κB是与炎症反应相关的基因表达调节分子[5－6]，在单核巨噬细胞膜上能激动NF－κB通路的受体主要有白细胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)，肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，抑制其中任何一种受体都可以抑制NF－κB的活性。目前尚无研究表明穿心莲内酯是通过膜受体产生效应，还是直接进入细胞内起作用，有关穿琥宁的研究更少。本研究采用高灵敏度的IN Cell Analyzer 2000活细胞成像系统，在特异性表达IL－1β或TNF受体的组成性表达增强绿色荧光蛋白偶联 NK－κBP65(enhanced green fluorescent protein－NF－κBP65)融合蛋白的CHO细胞模型上，评价穿琥宁对IL－1β和 TNF－α诱导的NF－κBP65核转位的抑制作用;在特异性表达LPS受体的组成性表达EGFP偶联促分裂原活化蛋白激酶 APk2(EGFP－mitogen activated protein kinase APk2，EGFP－MAPK－APk2)融合蛋白的BHK细胞模型上，评价穿琥宁对 LPS诱导的P38MAPK下游分子 MAPK－APk2核转位的抑制活性。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

穿琥宁(粉末)，成都一平科技发展公司。组成性表达EGFP－NF－κBP65融合蛋白的CHO细胞购自美国Thermo公司;组成性表达 EGFP－MAPKAPk2融合蛋白的BHK细胞购自美国GE公司;RAW264.7细胞(单核巨噬细胞)购自协和细胞资源库;小鼠抗血红素加氧酶－1(heme oxygenase－1，HO－1)抗体、兔抗iNOS抗体和兔抗COX－2抗体均购自香港Abcam公司;小鼠抗β肌动蛋白抗体购自Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG抗体(二抗)均购自北京中杉金桥公司;杀稻瘟素(blasticidin)购自上海希美生物公司;IL－1β和TNF－α购自美国 PEPROTECH公司，kBα抑制剂(kBα inhibitor，IκBα)特异性抑制剂 Ro106－9920购自美国Merck公司;LPS和锌原卟啉(zinc protoporphyrian，ZnPP)(HO－1 活性抑制剂)购自美国Sigma公司;WST－8细胞计数试剂盒购自北京钮因华信科技发展有限公司;一氧化氮(nitric oxide，NO)检测试剂盒购自南京建成生物有限公司;前列腺素E2(prostaglandine E2，PGE2)ELISA试剂盒购自泰泽瑞达(北京)科技有限公司;胎牛血清、G418、F12培养液和 DMEM培养液购自美国Gibco公司;染色液购自美国Invitrogen公司。IN Cell Analyzer 2000活细胞成像系统，美国GE公司;GENios pro酶标仪，瑞士TECAN公司;垂直电泳槽，美国 Bio－Rad公司;DYY－8C 型电泳仪，北京六一仪器厂;Thermo Froma 311型水套式CO2培养箱，美国Thermo公司;凝胶成像仪，美国Kodak公司。

1.2 激动剂和化合物的配制

激动剂IL－1β用含0.1%胎牛血清的PBS配成10 mg·L－1母液，用分析培养液配成20 μg·L－1(4 ×，终浓度 5 μg·L－1)工作液;IκBα 抑制剂 Ro106－9920 用 DMSO 配成 25 mmol·L－1母液，分析培养液配成200 μmo·lL－1(4×，终浓度50 μmol·L－1);激动剂 TNF－α用含0.1%胎牛血清的 PBS配成100 mg·L－1母液，用分析培养液配成 40 μg·L－1(4 ×，终浓度10 μg·L－1);激动剂LPS 用PBS 配成1 g·L－1母液，用分析培养液配制成4 mg·L－1(4 ×，终浓度1 mg·L－1)工作液;穿琥宁用1%NaHCO2水溶液配成40 mmo·lL－1母液，用分析培养液配成4×工作液，选用3，10，30 和100 μmol·L－1连续4 个浓度。工作液临用前配制，20 min内使用。

1.3 细胞培养

组成性表达 EGFP－NF－κBP65 融合蛋白的CHO 细胞培养于含 G4180.5 g·L－1、杀稻瘟素5 mg·L－1和10% 胎牛血清的F12培养液中;组成性表达EGFP－MAPK－APk2融合蛋白 BHK 细胞，培养于含G4180.5 g·L－1和10%胎牛血清的F12培养液中;RAW264.7细胞，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。上述细胞培养条件均为37℃，5%CO2培养。

1.4 细胞存活率测定

按照WST－8细胞计数试剂盒说明书测定细胞存活率。RAW264.7细胞悬液(1×108L－1)按每孔100 μl加入96孔板中(边缘孔用无菌水填充)，培养过夜。每孔加入含穿琥宁终浓度分别为3，10，30和100 μmol·L－1的培养液10 μl，细胞对照和空白对照(不加细胞)组加等体积培养液，每组设7复孔，在培养箱培养24 h后每孔加入WST－8试剂10 μl，在培养箱孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm波长的吸光度(A)值。细胞存活率(%)=(A药物－A空白对照)/(A细胞对照－A空白对照)× 100%

1.5 抑制IL－1β 和TNF－α 诱导NF－κBP65 核转位分析

将组成性表达 EGFP－NF－κBP65融合蛋白的CHO 细胞按每孔100 μl(含1.5×104细胞)接种于预铺细胞黏附剂的96孔黑色孔底透光的细胞培养板中，在37℃，5%CO2培养18～24 h。每孔细胞用100 μl分析培养液洗 3 次，换 100 μl分析培养液，分细胞对照组、IL－1β 5 μg·L－1激动剂组、Ro106－9920(阳 性 对 照)50 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1组及穿琥宁 3，10，30 和 100 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1组，每组设3 复孔。阳性对照和穿琥宁组CHO细胞先与 Ro106－9920或穿琥宁作用60 min，再加入 IL－1β 作用 40 min，测定穿琥宁对IL－1β诱导的NF－κBP65核转位的影响。CHO 细胞分细胞对照组、TNF－α 10 μg·L－1激动剂组及穿琥宁 3，10，30 和 100 μmol·L－1+TNF－α 10 μg·L－1组，每组设3复孔。穿琥宁组CHO细胞先与穿琥宁作用60 min，再加入 TNF－α作用60 min，测定穿琥宁对 TNF－α诱导的 NF－κBP65核转位的影响。每孔细胞用染色液 200 μl洗 3 次，并留在200 μl染色液中室温染色1 h。细胞在 IN Cell Analyzer 2000活细胞成像系统上检测细胞质和细胞核荧光强度，每孔5个视野连续拍照。使用GE公司IN Cell Analyzer 1000 Nuclear Trafficking Analysis Module软件分析细胞核与细胞质荧光强度比值，表示报告基因核转位，并计算穿琥宁抑制核转位的活性。穿琥宁抑制率(%)=(激动剂处理细胞核转位－穿琥宁处理细胞核转位)/(激动剂处理细胞核转位－对照组细胞核转位)×100%。

1.6 抑制LPS诱导MAPK－APk2核转位分析

将组成性表达EGFP－MAPK－APk2融合蛋白的BHK 细胞按每孔100 μl(含1.5 ×104个细胞)接种于预铺细胞黏附剂的96孔黑色孔底透光的细胞培养板中，37℃，5%CO2培养18～24 h。每孔细胞用100 μl分析培养液洗3 次，换100 μl分析培养液，分细胞对照组、LPS 1 mg·L－1激动剂组和穿琥宁 3，10，30 和 100 μmol·L－1+LPS 1 mg·L－1组，每组设3复孔。穿琥宁组BHK细胞先与穿琥宁作用60 min，再加入LPS作用30 min，测定穿琥宁对LPS诱导的MAPK－APk2核转位的影响。每孔细胞用染色液200 μl洗 3 次，并留在200 μl染色液中室温染色1 h。同1.5测定并计算穿琥宁抑制核转位的活性。穿琥宁抑制率(%)=(穿琥宁处理细胞核转位－激动剂处理细胞核转位)/(对照组细胞核转位－激动剂处理细胞核转位)×100%。

1.7 Western 印迹法测定 HO－1，iNOS 和 COX－2蛋白表达

RAW264.7细胞培养于60 mm细胞培养皿中，用含穿琥宁终浓度分别为3，10，30 和100 μmol·L－1培养液培养4 h后，弃培养液，用冷PBS清洗3次，加入细胞裂解液，裂解细胞提取细胞全蛋白，考马斯亮蓝法测蛋白质浓度，所提取的蛋白质用于检测HO－1的表达。同样将 RAW264.7细胞培养于60 mm细胞培养皿中，分细胞对照组、IL－1β 5 μg·L－1组、IL－1β 5 μg·L－1+ 穿琥宁 100 μmol·L－1组和 IL－1β 5 μg·L－1+ 穿琥宁 100 μmol·L－1+ZnPP 5 μg·L－1组，分别处理细胞 6 h，提取总蛋白质用于检测COX－2蛋白表达;分别处理12 h，提取总蛋白质用于检测iNOS蛋白表达。取蛋白质40 μg上样，10%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，随后电转移至硝酸纤维素膜，分别用抗 HO－1抗体(1∶2000)，COX－2 抗体 (1 ∶1000)，iNOS 抗 体(1∶1000)或β肌动蛋白抗体(1∶5000)一抗孵育过夜，洗膜，加入二抗孵育1 h，洗膜，发光液孵育，凝胶成像系统通过Quantity one软件分析各条带的积分吸光度(integrated absorbance，IA)。目的蛋白的相对表达水平用 IA目的蛋白/IAβ肌动蛋白比值表示。

1.8 细胞培养液中PGE2和NO含量测定

RAW264.7细胞培养于60 mm细胞培养皿中，分细胞对照组、IL－1β 5 μg·L－1组、IL－1β 5 μg·L－1+穿琥宁 100 μmol·L－1组，IL－1β 5 μg·L－1+ 穿琥宁100 μmol·L－1+ZnPP 5 μg·L－1组，分别处理细胞6 h，取培养液，按试剂盒说明书测定PGE2含量;分别处理12 h，取培养液，按试剂盒说明书测定NO含量。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 穿琥宁的细胞毒性作用

穿琥 宁 3，10，30 和 100 μmol·L－1处 理RAW264.7细胞24 h，与细胞对照组比较，A450nm均未发生明显变化，细胞存活率均在100%以上，表明穿琥宁小于100 μmol·L－1无明显细胞毒性(表1)。

Tab.1 Effect of Chuanhuning on viability of RAW264.7 cells

2.2 穿琥宁对IL－1β 诱导NF－κBP65核转位的影响

IL－1β 受体激动剂 IL－1β 能诱导 NF－κBP65 荧光蛋白从胞浆向核内转位，IκBα特异性抑制剂Ro106－9920能完全阻断其核转位效应，其抑制率为100%(图 1)。经计算，穿琥宁 3，10，30 和100 μmol·L－1对 IL－1β 诱导 NF－κBP65 核转位无抑制作用，抑制 率 分 别 为 (9.3±7.8)%，(7.1±8.3)%，(4.7±8.3)%和(－4.5±8.6)%(n=3)，提示穿琥宁的抗炎镇痛作用可能不是IL－1β受体所介导的。

2.3 穿琥宁对TNF－α诱导NF－κBP65核转位的影响

TNF－α 受体激动剂 TNF－α 能诱导 NF－κBP65荧光蛋白从胞浆向核内转位(图2)。穿琥宁3，10，30 和 100 μmol·L－1对 TNF－α 诱导 NF－κBP65核转位有较弱的抑制作用，经计算其抑制率分别为(19.9±7.2)%，(18.1±8.5)%，(15.9±7.6)%和(16.2±8.8)%(n=3)，提示穿琥宁的主要抗炎镇痛作用可能不是由TNF－α受体介导的。

Fig.1 Effect of Chuanhuning on nuclear transfer of NF－κBP65 induced by interlukin－1β(IL－1β)in CHO cells with enhanced green fluorescent protein(EGFP)－NF－κBP65(×20).The green fluorescence was detected by IN Cell Analyzer 2000 live cell imaging system.A:control group，CHO cells were incubated in medium for 100 min，GFP was distributed in cytoplasm;B:IL－1β 5 μg·L －1group，CHO cells were incubated in medium for 60 min，then with IL－1β for 40 min，NF－κBP65 with GFP was transferred to the nucleus as shown by arrow;C:Ro106－992050 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1group，CHO cells were incubated with Ro106－9920 for 60 min，then coincubated with IL－1β for 40 min，nuclear transfer effect of GFP was blocked;D:Chuanhuning 100 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1group，CHO cells were incubated with Chuanhuning for 60 min，then coincubated with IL－1β for 40 min，nuclear transfer effect of NF－κBP65 could not be inhibited and GFP could still be observed in the nucleus as shown by arrow.

Fig.2 Effect of Chuanhuning on nuclear transfer of NF－κBP65 induced by tumor necrosis factor－α (TNF－α)in CHO cells with EGFP－NF－κBP65(×20).The green fluorescence was detected by IN Cell Analyzer 2000 live cell imaging system.A:control group，CHO cells were incubated in medium for 120 min，GFP was distributed in the cytoplasm and almost invisible in nucleus;B:TNF－α 10 μg·L－1group，CHO cells were incubated in medium for 60 min，then with TNF－α for 60 min，NF－κBP65 with GFP was transferred to the nucleus as shown by arrow;C:Chuanhuning 100 μmol·L －1+TNF－α 10 μg·L －1group，CHO cells were incubated with Chuanhuning for 60 min，then coincubated with TNF－α for 60 min，nuclear transfer effect of NF－κBP65 could not be inhibited and GFP could still be observed in the nucleus as shown by arrow.

2.4 穿琥宁对LPS诱导MAPK－APk2核转位的影响

LPS受体激动剂LPS能诱导MAPK－APk2荧光蛋白从细胞核向细胞浆转位(图3)。穿琥宁3，10，30 和 100 μmol·L－1对 LPS 诱导 MAPK－APk2核转位无抑制作用，经计算其抑制率分别为(－6.1±4.8)%，(－5.7±4.7)%，(－ 5.0±4.8)% 和(－4.8±5.8)%(n=3)，提示穿琥宁的抗炎镇痛作用可能不是由LPS受体介导的。

Fig.3 Effect of Chuanhuning on nuclear transfer of mitogen activated protein kinase APk2(MAPK－APk2)induced by lipopolysaccharides(LPS)in BHK cells with EGFP－MAPK－APk2(×20).The green fluorescence was detected by IN Cell Analyzer 2000 live cell imaging system.A:control group，BHK cells were incubated in medium for 90 min，GFP gathered in the nucleus without agonist;B:LPS 1 mg·L －1group，BHK cells were incubated in medium for 60 min，then with LPS for 30 min，MAPK－APk2 with GFP was transferred to the cytoplasm under stimulating with LPS as shown by arrow;C:Chuanhuning 100 μmol·L －1+LPS 1 mg·L －1group，CHO cells were incubated with Chuanuning for 60 min，then coincubated with LPS for 30 min，nuclear transfer effect of MAPK－APk2 could not be inhibited as shown by arrow.

2.5 穿琥宁对RAW264.7细胞HO－1蛋白表达的影响

如图4 所示，穿琥宁10，30 和100 μmol·L－1分别处理RAW264.7细胞4 h，能够诱导HO－1蛋白的表达(P＜0.01);穿琥宁3 μmol·L－1作用不明显。

Fig.4 Effect of Chuanhuning on heme oxygenase－1(HO－1)expression in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with Chuanhuning for 4 h.The expression of HO－1 was determined with Western blotting(A)and expressed as IAHO－1/IAβ－Actin(B).IA:integrated absorbance.Lane 1:cell control;lane 2－5:Chuanhuning 3，10，30 and 100 μmol·L －1，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 穿琥宁对 RAW264.7细胞 COX－2表达和PGE2产生的影响

Fig.5 Effect of Chuanhuning on cyclooxygenase 2(COX－2)expression stimulated by IL－1β in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with IL－1β，Chuanhuning+IL－1β or Chuanhuning+IL－1β +zinc protoporphyria(ZnPP)for 6 h，respectively.The expression of COX－2 was determined with Western blotting(A)and expressed as IACOX－2/IAβ－Actin(B).1:cell control;2:IL－1β 5 μg·L －1;3:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1;4:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1+ZnPP 5 μmol·L －1 .±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group;##P＜0.01，compared with IL－1β 5 μg·L －1group;△△P＜0.01，compared with Chuanhuning+IL－1β group.

如图5 所示，在 IL－1β 刺激下，RAW264.7 细胞COX－2表达明显增高(P＜0.01)，穿琥宁能明显抑制IL－1β的刺激作用(P＜0.01)，HO－1特异性拮抗剂ZnPP能部分逆转穿琥宁对IL－1β诱导COX－2表达的抑制作用(P＜0.01)。同样，如图6所示，穿琥宁抑制 IL－1β 诱导 PGE2的产生(P＜0.01)，ZnPP也部分逆转穿琥宁对IL－1β诱导产生的抑制作用(P＜0.05)。

Fig.6 Effect of Chuanhuning on production of prostaglanddins E2(PGE2)stimulated by IL－1β in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with IL－1β，Chuanhuning+IL－1β or Chuanhuning+IL－1β +ZnPP，respectively，for 6 h.The PGE2concentration was determined with PGE2kit.1:cell control;2:IL－1β 5 μg·L －1;3:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1;4:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1+ZnPP 5 μmo·lL－1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group;##P＜0.01，compared with IL－1β group;△P＜0.05，compared with Chuanhuning+IL－1β group.

2.7 穿琥宁对RAW264.7细胞iNOS表达和NO产生的作用

Fig.7 Effect of Chuanhuning on inducible nitric oxide synthase(iNOS)expression stimulated by IL－1β in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with IL－1β，Chuanhuning+IL－1β or Chuanhuning+IL－1β +ZnPP，respectively，for 12 h.The expression of iNOS was determined with Western blotting(A)and expressed as IAiNOS/IAβ－Actin(B).1:cell control;2:IL－1β 5 μg·L－1;3:Chuanhuning 100 μmo·lL－1+IL－1β 5 μg·L－1;4:Chuanhuning 100 μmo·lL－1+IL－1β 5 μg·L－1+ZnPP 5 μmol·L－1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group;##P＜0.01，compared with IL－1β group;△△P＜0.01，compared with Chuanhuning+IL－1β group.

如图7 所示，在 IL－1β 刺激下，RAW264.7 细胞iNOS表达明显高于细胞对照组(P＜0.01)，穿琥宁作用后其表达下降(P＜0.01)，HO－1特异性拮抗剂ZnPP部分逆转穿琥宁对IL－1β iNOS表达的抑制作用(P＜0.01)。同样，如图8所示，穿琥宁抑制IL－1β诱导NO的产生(P＜0.01)，ZnPP也部分逆转穿琥宁对IL－1β诱导NO产生的抑制作用(P＜0.01)。

Fig.8 Effect of Chuanhuning on production of nitric oxide(NO)stimulated by IL－1β in RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with IL－1β，Chuanhuning+IL－1β or Chuanhuning+IL－1β +ZnPP，respectively，for 12 h.The NO concentration was determined with kit.1:cell control;2:IL－1β 5 μg·L －1;3:Chuanhuning 100 μmol·L －1+IL－1β 5 μg·L －1;4:Chuanhuning 100 μmol·L－1+IL－1β 5 μg·L－1+ZnPP 5 μmo·lL－1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group;##P＜0.01，compared with IL－1β group;△△P＜0.01，compared with Chuanhuning+IL－1β group.

3 讨论

本研究结果显示，穿琥宁对CHO细胞IL－1β受体和BHK细胞LPS受体无抑制作用，对CHO细胞TNF－α受体仅具有较弱的抑制活性(抑制强度20%)，且无明显的浓度效应关系。但是，在RAW264.7细胞模型上，穿琥宁能显著抑制 IL－1β刺激产生的炎性蛋白iNOS和COX－2的表达及NO和PGE2生成，提示NF－κB通路可能不是穿琥宁抗炎作用的主要机制。

炎症是组织对损伤因子产生的复杂防御反应。刺激单核巨噬细胞释放大量炎症因子的信号通路，除了NF－κB这条经典的抗炎通路外，还存在其他的抗炎通路。目前研究较多的是HO－1，HO－1是血红素代谢的限速酶和起始酶，能将血红素代谢成一氧化碳、胆绿素和游离的铁离子[7]，这些代谢产物都是重要的生物效应分子，在抗氧化、抗炎和抗增殖中发挥着重要的作用[8－10]。据报道，穿心莲内酯能够诱导 HO－1 的高表达[11]。本研究在 RAW264.7 细胞模型上，发现穿琥宁也能够诱导HO－1表达增加，抑制由IL－1β刺激产生的iNOS和COX－2高表达及NO和PGE2生成;HO－1特异性拮抗剂ZnPP能显著阻断穿琥宁的作用，部分逆转穿琥宁对炎性物质释放的抑制作用，提示穿琥宁能促进HO－1蛋白表达，其抗炎作用可能主要是通过促进HO－1蛋白表达，继而抑制 iNOS，COX－2，NO 和 PGE2等炎性物质的生成和释放，最终发挥抗炎作用。综上所述，NF－κB信号通路可能不是穿琥宁发挥抗炎作用的主要通路，其抗炎作用可能是通过HO－1信号通路发挥作用。HO－1信号通路与NF－κB信号通路之间相互调节机制尚不清楚。本研究为阐明穿琥宁的抗炎作用机制奠定了基础，也为 HO－1信号系统与NF－κB通路可能存在相互调节的研究提供了实验依据。

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