丹皮酚体外对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

魏东华，孔德松，张自力，倪春艳，张雪娇，郑仕中，3

(1.哈尔滨医科大学大庆校区药学院，黑龙江大庆 163319;2.南京中医药大学中药学一级学科，江苏南京 210046;3.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京 210046)

肝纤维化是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应，其实质是肝内细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成大于降解导致大量ECM过度沉积[1]。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化增殖是肝纤维化进程中的关键环节。HSC是肝ECM的主要来源，是肝纤维化形成的细胞学基础，在ECM代谢和多种细胞介质产生过程中处于中心地位。抑制HSC增殖、减少活化HSC数量并诱导HSC的凋亡将有利于肝纤维化的逆转[2]。

丹皮酚(paeonol)是毛莨科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的根皮和萝摩科植物徐长卿〔Cynanchum paniculatum(Bge.)Kitag.〕干燥根及根茎的主要有效成分。丹皮酚是一种小分子的酚类化合物，分子式为C9H10O3，化学结构是2-羟基4-甲氧基苯乙酮。丹皮酚具有镇静催眠、解热镇痛、抗菌消炎、免疫调节、抗氧化及保护心脑血管等广泛的药理活性[3－5]。近期研究表明，丹皮酚对人肝癌细胞增殖具有抑制作用，对多种慢性肝病和病毒性肝炎也具有良好的治疗作用[6－8]。本研究主要观察丹皮酚体外对HSC增殖抑制和凋亡诱导作用，初步探讨丹皮酚抗肝纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物、细胞、主要试剂和仪器

丹皮酚，宁波天真制药有限公司。HSC细胞，上海肯强实业有限公司。DMEM培养基和小牛血清，美国Gibco公司;胰蛋白酶，韩国BioSHARP公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;Hoechst染色试剂盒，海门碧云天生物技术研究所;AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒，南京凯基生物。光学显微镜，德国莱卡公司;超低温冰箱，美国纽艾尔公司;CO2细胞培养箱，美国 FORMA公司;FACS Salibur型流式细胞仪，美国BD公司。

1.2 细胞培养

HSC细胞接种于无菌培养瓶中，加入适量的高糖DMEM培养液(含10%小牛血清)，于5%CO2，37℃饱和湿度的培养箱中培养，传代时用0.25%胰酶消化，细胞生长至70%～80%融合率进行实验。

1.3 MTT法检测细胞存活

取生长状态良好的HSC，用胰蛋白酶消化成细胞悬液，接种于96孔板中，每孔5×103细胞。常规培养48 h后，弃去培养基，细胞分为对照组和药物组，对照组加入含有0.4%小牛血清的高糖DMEM培养基，药物组加入丹皮酚使其终浓度分别为1.66，3.32，8.3，16.6，33.2 和 49.8 mg·L－1，每孔培养体积180 μl，每组设6复孔。培养48 h后，于各孔分别加入 20 μl的 MTT 溶液(0.5%)，置37℃，5%CO2培养箱内孵育，4 h 后加入 200 μl DMSO，在微型振荡器震荡10 min后，用全自动酶标仪在490 nm波长处测定各孔A值。对细胞存活的抑制率(%)=(1－A药物组/A对照组)×100%。

1.4 锥虫蓝染色法检测细胞存活率

取对数生长期HSC，加入丹皮酚，终浓度分别为1.66，8.3，16.6，33.2 和49.8 mg·L－1，于5%CO2，37℃饱和湿度的培养箱中培养。培养48 h后加入锥虫蓝，显微镜下计数活细胞，计算细胞存活率，观察丹皮酚抑制HSC存活的浓度效应关系。丹皮酚33.2 mg·L－1与 HSC 孵育 6，12，24，36 和48 h，用锥虫蓝染色法测定细胞存活率，观察丹皮酚抑制HSC存活的时间效应关系。

1.5 LDH释放实验检测细胞毒性

取生长状态良好的HSC细胞，用0.25%的胰酶消化成细胞悬液，接种于96孔板中，每孔5×103细胞。常规培养24 h后，弃去培养基，加入含有0.4%小牛血清的高糖DMEM培养基和丹皮酚，丹皮酚终浓度分别为 1.66，3.32，8.3，16.6，33.2 ，49.8 和 69.7 mg·L－1，每孔总体积 200 μl，每组设6复孔。于37℃，5%CO2培养箱内孵育48h后轻轻吸取细胞上清，按试剂盒说明书测定LDH活性。实验重复3次。

1.6 细胞形态学观察

将严格清洁、浸酸、消毒的洁净盖玻片放置于6孔培养板中，加入HSC 5×107，置37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，待细胞爬于盖玻片后，分别加入丹皮酚，丹皮酚终浓度为16.6，33.2 和49.8 mg·L－1，同时设DMEM培养基对照组，于24 h分别于显微镜下观察，拍照，观察细胞形态变化。

1.7 Hoechst染色检测细胞凋亡

取洁净盖玻片在75%乙醇中浸泡5 min，无菌超净台内吹干，再用细胞培养液洗涤1次。将盖玻片置于6孔板内，加入细胞培养过夜，在盖波片上长满至50%～80%。丹皮酚终浓度分别为1.66，8.3，16.6，33.2 和 49.8 mg·L－1，与细胞孵育24 h。参考Yuan等[9]方法进行Hoechst染色。于荧光显微镜下检测，激发波长350 nm。

1.8 流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期

将生长良好的 HSC用0.25%胰酶消化，用DMEM培养液悬浮细胞，接种于6孔板中，每孔3×105细胞。待细胞贴壁，呈单层融合后(约12 h)，弃去上清液，更换为含0.4%小牛血清的DMEM培养液，并加入丹皮酚，使其终浓度分别为1.66，8.3，16.6，33.2和49.8 mg·L－1，培养24 h 后用不含EDTA的胰酶收集细胞，PBS洗细胞2次，收集(1～5)×105细胞，按试剂盒说明分别加入AnnexinⅤ/PI双染试剂，避光作用5～15 min后用流式细胞仪测定细胞凋亡率。实验重复3次。

细胞给药浓度同HSC凋亡率检测，培养48 h后用0.25%的胰酶收集细胞，PBS洗细胞2次，70%乙醇过夜固定。收集(2～3)×104细胞，按试剂盒说明分别加入PI单染试剂，避光作用5～15 min后用流式细胞仪测定细胞周期，实验重复3次。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 丹皮酚对HSC存活率的影响

表1结果表明，丹皮酚对HSC存活具有明显抑制作用，且具有浓度效应关系(r=0.955，P＜0.05)，作用48 h 时 IC50值为105.4 mg·L－1。图1结果表明，丹皮酚对HSC存活的抑制作用不仅具有浓度效应关系(r=－0.936，P＜0.05)，在浓度为33.2 mg·L－1时还具有时间效应关系(r=－0.965，P＜0.05)。

Tab.1 Inhibition of paeonol on hepatic stellate cell(HSC)survival

Fig.1 Effect of paeonol on HSC viability assayed by trypan blue dye.A:HSC were treated with paeonol for 48 h.B:HSC were treated with paeonol 33.2 mg·L－1for 6，12，24，36 and 48 h.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control(0)group.

2.2 丹皮酚对HSC的细胞毒性作用

LDH释放实验结果表明，丹皮酚在1.66～69.7 mg·L－1作用 48 h，HSC 细胞培养上清 LDH活性与对照组比较无明显变化(图2)，表明在此浓度范围内丹皮酚对HSC无细胞毒性。

2.3 丹皮酚对HSC凋亡形态的影响

Fig.2 Effect of paeonol on lactate dehydrogenase(LDH)release of HSC cells.HSC were treated with paeonol 1.66 －69.7 mg·L －1for 48 h，then LDH activity in culture supernatant was detected by LDH activity detection kit.

显微镜下，对照组HSC细胞形状不规则，胞体呈卵圆形或不规则形，常伸出数个星状突起，贴壁生长良好(图3A)。丹皮酚 16.6～49.8 mg·L－1作用24 h，细胞胞体变小，变圆，贴壁细胞数目减少，胞浆透亮度下降，颗粒感增强，部分细胞胞突回缩变圆，脱落呈悬浮状，细胞膜崩溃，可见细胞碎片(图3B，C，D)。荧光显微镜下可见丹皮酚在1.66～49.8 mg·L－1浓度范围内，HSC有细胞核破碎、固缩、边缘化等凋亡特征的出现，并且随着浓度增加，凋亡细胞也明显增多(图4)，表明丹皮酚具有促进HSC细胞凋亡的作用。

Fig.3 Effect of paeonol on morphological changes of HSC(DAB，×100).HSC were incubated with paeonol for 24 h，morphological changes were observed under a Leica microscope.↑:cell debris.A:control;B，C and D:paeonol 16.6，33.2 and 49.8 mg·L－1.

2.4 丹皮酚对HSC凋亡和细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果表明，丹皮酚1.66～49.8 mg·L－1作用24 h能够显著促进 HSC 凋亡，且具有浓度效应关系(r=0.920，P＜0.05)(图5，表2)。同时发现，丹皮酚 33.2 和49.8 mg·L－1作用48 h可调节细胞周期，G0/G1期细胞增加(P＜0.01)，S 期细胞减少(P＜0.01)，具有浓度效应关系(r=0.980，P＜0.05)(图6，表2)。

Fig.4 Effect of paeonol on apoptosis characteristics of HSC(Hoechst 33258，×200).↑:apoptotic HSC.A:control;B－F:paeonol 1.66，8.30，16.6，33.2 and 49.8 mg·L －1for 24 h.

Fig.5 Effect of paeonol on apoptosis of HSC detected with flow cytometry of annexinⅤ-FITC/PI double-staining.See Fig.4 for the cell treatment.A:control;B －F:paeonol 1.66，8.30，16.6，33.2 and 49.8 mg·L－1for 24，respectively.

Fig.6 Effect of paeonol on cell cycle of HSC analyzed by flow cytometry.A:control;B －F:paeonol 1.66，8.30，16.6，33.2 and 49.8 mg·L －1for 48 h，respectively.

Tab.2 Effect of paeonol apoptosis and cell cycle of HSC

3 讨论

持续的肝损伤可损害肝实质细胞和枯否细胞，这些细胞可分泌多种细胞因子并产生活性氧，激活处于静止期的HSC，使之转变为分泌胶原能力更强的肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)，致使ECM大量沉积，形成肝纤维化[2]。研究表明，抑制HSC激活或促进其凋亡可逆转肝纤维化，且临床患者在进行相关肝纤维化的诊治时大都已处于肝纤维化中晚期，此时患者体内存有大量的活化型 HSC和MFB，造成肝纤维化持续恶化。因此，研究促HSC凋亡的药物及其作用机制可能更具实用价值，抑制HSC增殖、诱导其凋亡的药物也将成为抗肝纤维化治疗的重要手段[10]。

近年来，随着研究的深入，中药天然产物丹皮酚新发现的药理作用逐渐引起人们的注意。丹皮酚可诱导在体小鼠肝癌细胞凋亡，降低Bcl-2/Bax比值，而且升高其脾细胞和巨噬细胞活化后白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的表达[11]。丹皮酚能够显著抑制乙醇灌胃导致的大鼠酒精性肝损伤，降低血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶活性，减少肝细胞脂肪变性、炎症细胞浸润及肝细胞凋亡[12]。在一些治疗慢性肝炎的中药复方制剂如复方益肝丸和肝康复等中，丹皮酚是这些药物发挥药效作用的重要成分和药物质量的检测标准[13－14]。丹皮酚对上述各种肝损伤具有良好的改善作用，那么丹皮酚是否在抗肝纤维化方面也有突出作用，其对HSC的作用又是如何，是否可以像对上述肝癌细胞那样抑制HSC的增殖并诱导其凋亡，至今未见相关报道。本研究重点阐述丹皮酚对HSC增殖和凋亡的影响，为开发新型、有效抗肝纤维化药物提供依据。

本研究结果表明，丹皮酚可抑制HSC增殖，表现为细胞形态和细胞存活率的改变。进一步研究发现，丹皮酚可诱导HSC凋亡。另外，丹皮酚对HSC细胞增殖抑制作用主要在于其能使细胞由G0/G1期进入S期的过程受阻，导致G0/G1期细胞增加，处于S期与G2/M期的细胞则相应减少，同时细胞的凋亡率明显增加。目前认为细胞周期有2个突发性的转折点:G1→S及G2→M期[15]。因此可以认为，丹皮酚对于细胞周期的G1→S重要转折点的调控作用可能是抑制HSC细胞增殖的关键所在，提示丹皮酚抗肝纤维化的作用可能是通过影响HSC的增殖周期并诱导其凋亡实现的。

经过众多研究者多年来不断深入的研究，人们对HSC增殖与凋亡的机制已日渐了解，并已发现一些可抑制HSC增殖、促进其凋亡的药物。如胶霉毒素(gliotoxin)、芦荟布洛芬(aloeemodin)和丹参酮(tanshinone)等可通过影响线粒体凋亡途径诱导HSC凋亡;姜黄和罗西格列酮(rosiglitazone)抑制HSC增殖的效应是通过上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ实现的;柳氮磺吡啶(sulfasalazine)等通过抑制核转录因子2JB途径来促进HSC凋亡;中药红花(Carthamus tinctorius)可促进Fas活化[16－17]。HSC的增殖与凋亡调控是一个复杂的过程，不同药物可通过不同的途径或多途径同时发挥促HSC凋亡的作用。本研究只是从细胞水平阐明丹皮酚可以影响HSC的增殖周期，促进其凋亡，其具体分子机制及其与其他药物相比的作用效果和作用方式等仍需深入研究。

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