槲皮素对大剂量X线暴露所致PC12细胞氧化性损伤的保护作用

喻 晶，张继青，葛 宁，刁 波，张 宜，陈福慈，吕 玲，罗远菊，刘 宏

(广州军区武汉总医院1.药剂科，3.肿瘤放疗科，4.医学实验科，湖北武汉 430070;2.湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065)

随着核能在国民经济和军事领域中的广泛应用，各种辐射事故和灾难导致的放射性物质泄漏时有发生。人体在短时间内暴露于大剂量射线辐照环境中，会诱导产生具有强氧化活性的自由基，使细胞膜、DNA和蛋白质等生物大分子发生脂质过氧化[1－3]，引起直接受照组织和细胞的辐射损伤。因此，从防护的角度减少或淬灭辐射诱导的自由基，终止或抑制其对生物组织和细胞产生的氧化性损伤一直是辐射防护研究的核心问题之一[4]。槲皮素(quercetin)是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜、水果和茶叶中[5]，具有显著的抗氧化和清除自由基的作用[6－7]。本研究从细胞水平探讨槲皮素对大剂量辐射所致PC12细胞氧化性损伤的保护作用及其可能的作用机制，以期为黄酮类化合物在神经系统辐射防护方面的研究和利用积累资料。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

槲皮素(批号:QU20101102，纯度98.7%)购自郑州荔诺生物科技有限公司。DMEM高糖培养基购自Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自NQBB公司;胰蛋白酶购自Amresco公司;噻唑蓝(MTT)购自Biosharp公司;二甲亚砜(DMSO)购自Sigma公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和总抗氧化能力(total antioxidative capacity，T－AOC)测试试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。Precise e1293医用直线加速器，瑞典ELECTA公司;RT－6500酶标分析仪，中国深圳雷杜生命科学股份有限公司;2120 UV紫外分光光度计，韩国QPTIZEN公司;F－4500荧光分光光度计，日本 Hitachi公司;CK2－TR倒置显微镜，日本Olympus公司。

1.2 细胞培养和药物配制

PC12细胞为神经生长因子诱导分化型，由本院医学实验科保存。细胞用含10%FBS，青霉素100 kU·L－1和链霉素100 mg·L－1的 DMEM 高糖培养液，以1.0×108L－1密度接种于培养瓶中，置于37℃，5%CO2饱和湿度的恒温培养箱内常规培养。取对数生长期的细胞进行实验。将槲皮素溶于DMSO，配成100 mmol·L－1储备液，－20℃保存，使用时用DMEM高糖全培养液稀释至实验浓度。

1.3 MTT法检测细胞增殖反应

将PC12细胞以1.0×108L－1的密度接种到96 孔板，每孔100 μl，待细胞90%融合后，加入槲皮素 6.25，12.5，25，50 和 100 μmol·L－1分别作用24，48和72 h，吸弃原培养液，PBS洗2次，每孔加入浓度为 5 g·L－1MTT 20 μl，于 37℃，5%CO2培养箱内继续培养4 h后，吸弃各孔MTT加入DMSO 100 μl，充分振摇培养板，用酶标仪测定波长492 nm处吸光度(A)值。每组设6复孔。

PC12 细胞与槲皮素 12.5，25 和 50 μmol·L－1预作用2 h后接受照射。本课题组采用从1～9 Gy多个辐射剂量进行了预实验，发现PC12细胞在经4 Gy X线辐照24 h后细胞周期出现明显的G0/G1期阻滞，故本研究在此基础上选取4 Gy X线，从辐照所致PC12细胞氧化性损伤的角度探讨槲皮素的辐射防护效果。照射条件:采用6 MeV X线，照射剂量为4 Gy，剂量率为2 Gy·min－1，皮靶距为60 cm，照射野为20 cm×20 cm。同时设正常对照组和辐射对照组。每组设6复孔。各组于照射后24 h用上述MTT法检测细胞增殖反应。

1.4 细胞SOD活性、MDA和ROS含量及T－AOC检测

将生长状态良好的细胞进行消化、计数，调整细胞密度为1.0×108L－1，接种到5个培养瓶中，每瓶5 ml，待细胞90%融合后，随机分成正常对照组、辐射对照组(4 Gy)、辐射 +槲皮素 12.5，25 和50 μmol·L－1组。PC12 细胞与槲皮素预作用 2 h 后再接受照射。照射条件同上。各组均于照射后24 h收集细胞，－80℃保存，备用。细胞常温裂解30 min后，混匀，取混悬液，用黄嘌呤氧化酶法检测细胞SOD活性，硫代巴比妥法检测MDA含量，菲啉络合法检测T－AOC，DCFH－DA探针法检测ROS含量，严格按照检测试剂盒说明书操作。ROS含量用荧光强度表示。以上实验重复3次。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 槲皮素对PC12细胞增殖反应的影响

与正常对照组比较，槲皮素在作用24 h(r=0.887，P＜0.01)和 48 h(r=0.872，P＜0.01)，PC12细胞增殖反应随槲皮素浓度的增加而增高;作用72 h，槲皮素对PC12细胞增殖反应具有明显的抑制作用，并随槲皮素浓度的增加抑制作用增强(r=0.942，P＜0.01)(表1)。

Tab.1 Effect of quercetin on PC12 cell proliferation in vitro

2.2 槲皮素对辐射损伤PC12细胞增殖反应的影响

由表2可以看出，与正常对照组比较，PC12细胞受辐射后细胞增殖反应明显降低(P＜0.01)。与辐照对照组比较，槲皮素12.5，25 和 50 μmol·L－1防护组PC12细胞增殖反应明显增强(P＜0.05，P＜0.01)，且具有浓度效应关系(r=0.751，P＜0.01)。

Tab.2 Effect of quercetin on proliferation of PC12 cells injured by X－ray in vitro

2.3 槲皮素对辐射损伤PC12细胞SOD活性、MDA含量、T－AOC和ROS的影响

由表3可以看出，与正常对照组比较，PC12细胞受辐射后SOD活性和T－AOC降低(P＜0.01)，MDA和ROS含量增加(P＜0.01)。与辐照对照组比较，槲皮素 12.5，25 和 50 μmol·L－1防护组PC12细胞 SOD 活性(r=0.837，P＜0.01)和T－AOC(r=0.940，P＜0.01)随槲皮素浓度增高而增高，MDA 含量(r=0.845，P＜0.01)和 ROS 含量(r=0.930，P＜0.01)随槲皮素浓度的增高而降低，表明槲皮素对PC12细胞的辐射防护作用具有浓度效应关系。

Tab.3 Effect of quercetin on superoxide dismutase(SOD)，malonedialdehyde(MDA)，total anti－oxidation capacity(TAOC)and reactive oxygen species(ROS)of PC12 cells injured by X－ray in vitro

3 讨论

据报道，槲皮素能减轻γ射线照射诱导的人外周血淋巴细胞的 DNA 损伤，其浓度在24 μmol·L－1时防护效果最佳[8]。槲皮素浓度＜100 μmol·L－1时对人视网膜色素上皮细胞的氧化性损伤具有保护作用，但浓度＞100 μmol·L－1时作用 24 h 后出现明显的细胞毒性[9]。本研究结果表明，槲皮素≤100 μmo·lL－1时作用24和48 h对PC12细胞具有促增殖作用，槲皮素≥12.5 μmol·L－1时作用72 h抑制细胞增殖，表现出明显的细胞毒性。由此可见，槲皮素对细胞增殖反应的影响具有双向性，且呈浓度依赖关系，与文献报道一致[10]。此作用机制可能是因外界刺激后导致细胞培养液中过氧化物的蓄积所致[11]。

电离辐射作为一种高能物理损伤因素，可通过电离激发机体产生大量自由基，当自由基产生过多而不能及时地清除时就会引起一系列的辐射损伤[12－13]，脂质过氧化产物MDA含量可反映细胞受自由基攻击的严重程度，SOD活性则反映细胞清除自由基的能力，两者间接体现出辐照后细胞内氧化损伤体系的强弱。本研究结果表明，X线辐射PC12细胞后胞内ROS增加、发生脂质过氧化、SOD 活性和T－AOC下降。槲皮素 12.5，25 和50 μmol·L－1均表现出明显的抗辐射效果，其抗辐射作用与槲皮素浓度呈良好的相关性。据报道，Na+/K+/2Cl－协同转运蛋白可能参与调控槲皮素对PC12细胞的生长分化[14]，其是否也参与槲皮素对辐射所致PC12细胞氧化性损伤的防护机制的调控有待研究。

本研究仅从槲皮素对辐射所致PC12细胞氧化性损伤的角度说明其具有一定的辐射防护作用，但这种神经保护作用可能还与诱导细胞凋亡、调控细胞周期和调节胞内信号等作用机制有关，故槲皮素辐射生物学作用的机制还有待更深层次的研究。此外，槲皮素是否能应用于临床放疗前或放疗中对非靶点组织的辐射防护，还需要更多的细胞学、实验动物学甚至临床实验等来验证。

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