注射用尖吻蝮蛇凝血酶对兔凝血功能的影响

樊 华，张 鹏，康 强，王秀英

(1.辽宁省食品药品检验所，辽宁沈阳 110023;2.沈阳市食品药品检验所，辽宁沈阳 110000)

蛇毒类凝血酶属胰蛋白酶家族中的丝氨酸蛋白酶，是蝮亚科蛇毒中一个具有促凝血活性的组成成分，能直接作用于纤维蛋白原，促进血液凝固。据报道，很多蛇毒成分已用于出血或血栓性疾病的诊断和治疗[1－3]。研究表明，蛇毒类凝血酶的主要药理学作用是对凝血因子、纤溶活性和血小板功能的影响[1－3]，如已上市的注射用血凝酶(hemocoagulase atrox for injection，HAI)，又名巴曲酶(batroxobin)，取自大具窃蝮蛇(矛头蛇，Bothrops atrox)，能够缩短正常人鞣花酸活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplatin，APTT)，且其主要成分巴曲酶能够促进血小板聚集等[4]。本研究应用兔作为实验动物观察蛇毒类凝血酶新型研发药—— 注射用尖吻蝮蛇(百步蛇，Agkistrodor acutus)凝血酶(hemocoagulase actutus for injection，Hem)对兔凝血功能指标的影响，观察其在治疗血液疾病方面是否存在优于已上市药物的疗效，为其进一步开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和仪器

普通级日本大耳白健康兔40只，体质量2.5～3.5 kg，雌雄各半，单笼饲养，挂牌标记，购自沈阳市双义实验动物研究所，实验动物生产许可证号:SCXK(辽)2003-0012;实验动物使用许可证号:SYXK(辽)2008-0008;动物室温度:19.6～21.8℃，湿度:40%～70%。Hem由沈阳守正生物技术有限公司提供，由蓬莱诺康药业有限公司生产，批号:080703;规格:每瓶含1 U Hem;用2 ml生理盐水溶解，静脉注射，也可肌内注射，成人每次1～2 U，质控材料由沈阳守正生物技术有限公司提供。阳性对照HAI，由瑞士素高药厂生产，每瓶含1克氏单位(Klobusitzky unit，KU)的血凝酶;成人每次1.0～2.0 KU，紧急情况下，立即静脉注射1.0 KU，同时肌内注射1.0 KU。凝血酶时间(thrombin time，TT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、血浆纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)和APTT检测试剂盒，保定天岳生物工程有限公司生产;0.9%氯化钠注射液，辽宁味邦生物制药有限公司生产。C2000-4型高性能血凝仪，北京普利生仪器有限公司;MEK-6318血球计数仪:日本光电工业株式会社。

1.2 动物分组和给药

日本大耳白兔随机分为正常对照组(生理盐水注射液)、Hem 0.25，0.5 和 1.0 U·kg－1及 HAI 1.0 KU·kg－1组，每组 8 只，经耳缘静脉一次性 iv给予，给药体积1 m·lkg－1。

1.3 凝血时间的测定

给药前(0 min)，给药后 10 min，30 min，2 h和12 h由耳缘静脉取血，应用Lee-White试管法[5]测定全血凝血时间(coagulation time，CT)。

1.4 血小板计数的测定

测定CT的同时，自耳静脉取血3 ml(抗凝剂∶血=1∶9，V/V)，应用血球计数仪计数给药前和给药后10 min，30 min，2 h 及 12 h 血小板(platelet，PLT)。

1.5 凝血因子的测定[6－8]

取1.4制备的抗凝血，500×g离心15 min，取上层血浆，应用C2000-4高性能血凝仪测定PT，TT，FIB 和 APTT。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 注射用尖吻蝮蛇凝血酶对兔凝血时间的影响

由表1可见，正常对照组各时间点CT无明显变化，给予 Hem 0.25，0.5 和 1.0 U·kg－1及 HAI 1.0 KU·kg－1后10 min～12 h与给药前相比CT 明显缩短(P＜0.05)。

2.2 注射用尖吻蝮蛇凝血酶对兔血小板计数的影响

由表2可见，正常对照组各时间点PLT无明显变化;Hem 0.25 和0.5 U·kg－1及 HAI 1.0 KU·kg－1给药后各时间点PLT与给药前比较未见明显变化;Hem 1.0 U·kg－1给药后10 和30 min其 PLT 均明显高于给药前(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of hemocoagulase actutus for injection(Hem)on coagulation time(CT)of rabbits

Tab.2 Effect of Hem on platelet(PLT)count of rabbits

2.3 注射用尖吻蝮蛇凝血酶对兔凝血因子的影响

由表3 可见，正常对照、Hem 0.25 和0.5 U·kg－1组各时间点 APTT 无明显变化，Hem 1.0 U·kg－1组10 min～2 h及 HAI 1.0 KU·kg－130 min～12 h 组APTT明显低于给药前(P＜0.05)。由表4可见，正常对照组各时间点PT 无明显变化，Hem 0.25 U·kg－1组10 min，0.5 U·kg－1组10 min～2 h 和1.0 U·kg－1组10～30 min及HAI 1.0 KU·kg－1组10～30 min PT 明显低于给药前(P＜0.05)。由表5可见，正常对照、Hem 0.25 和0.5 U·kg－1组各时间点TT 无明显变化，Hem 1.0 U·kg－1组10 min～12 h 和HAI 1.0 KU·kg－1组30 min TT明显低于给药前(P＜0.05)。由表6可见，正常对照组各时间点FIB无明显变化，Hem 0.25 U·kg－1组30 min，0.5 U·kg－1组10～30 min 和1.0 U·kg－1组10 min～2 h及 HAI 1.0 KU·kg－1组10～30 min FIB 明显高于给药前(P＜0.05)。

Tab.3 Effect of Hem on activated partial thromboplatin(APTT)of rabbits

Tab.4 Effect of Hem on prothrombin time(PT)of rabbits

Tab.5 Effect of Hem on thrombin time(TT)of rabbits

Tab.6 Effect of Hem on fibrinogen(FIB)of rabbits

3 讨论

目前已经发现40余种蛇毒中含有类凝血酶成分，并有20余种先后得到分离和纯化[3]，Hem就是其中之一。蛇毒类凝血酶在临床上主要用于止血、抗血栓和诊断试剂等方面。本研究通过检测CT，PLT以及PT，TT，APTT和FIB 4个凝血因子，观察Hem对血小板功能和凝血因子的影响。研究结果表明，给予兔 Hem 0.25，0.5 和 1.0 U·kg－1和HAI 1.0 kU·kg－1后 10 min，30 min，2 h 和 12 h 4个不同时间点与给药前相比CT明显缩短(P＜0.05)。同时 Hem 1.0 U·kg－1给药后10 min 与给药前相比即可见PLT明显增高(P＜0.05)，可维持至30 min(P＜0.05)，提示Hem可以促凝血，Hem 1.0 U·kg－1作用较显著。另外，HAI在给药后10 min～12 h与给药前比较PLT无明显变化，考虑其凝血作用机制可能并不是通过增加PLT实现的，这与文献报道相吻合[9－10]。不同来源的蛇毒类凝血酶其对血浆蛋白的作用方式并不相同。综合PT，TT，FIB和APTT 4项指标，Hem对PT，TT，FIB和APTT在不同时间点均有不同程度的影响，Hem 1.0 U·kg－1均在给药后10 min即出现明显的药效作用，特别是可以使TT缩短并维持至12 h。其作用机制尚待进一步研究。

本实验过程中通过兔耳缘静脉反复多次采血，血液质量影响指标检测结果的可靠性。耳静脉采血无疑是一种方便且创伤小的方法，但对操作者的技术要求和实验动物自身的要求较为严格，故建议在实验操作过程中应熟练掌握采血技术并严格控制时间，同时可通过实验组别、采血顺序设计和采血人员交替等方法尽量减少人为误差。

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